馮英秋 周妮娜 劉清蓮 金占國(guó)

Thompson[1]首先報(bào)道了Treacher collins綜合征（treacher collins syndrom，TCS）的癥狀和體征，Treacher Collin[2]首次將其定義為顴骨和下眼瞼缺損綜合征，該病新生兒的發(fā)生率約為1/5000[3]，為一種常染色體顯性遺傳病[4]。由于基因突變導(dǎo)致的顱面骨發(fā)育不全形成特征性魚樣面容，此外還伴有顴骨與下頜發(fā)育不良、唇裂、巨口、外耳道閉鎖等常見臨床體征，基因突變定位于染色體5q32-5q33.1的TCOF1基因上[5], 目前已發(fā)現(xiàn)250余種突變位點(diǎn)[6]。有文獻(xiàn)報(bào)道POLR1D和POLR1C的基因突變也可導(dǎo)致TCS[7，8]。本研究為門診1例疑似TCS散發(fā)病例進(jìn)行基因突變檢測(cè)明確診斷，并對(duì)該病的臨床特征和發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了分析和總結(jié)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

患兒，男性，5個(gè)月，北京籍社區(qū)衛(wèi)生轄區(qū)患者，足月剖宮產(chǎn)，因雙耳聽力篩查未通過(guò)，到社區(qū)全科門診就診。

1.2 方法

1.2.1 聽力學(xué)及體格檢查 全身及耳科?？茩z查，純音聽閾應(yīng)用B.K.2231型聽力計(jì)（丹麥）進(jìn)行檢測(cè)，聲導(dǎo)抗測(cè)試應(yīng)用Madsen 901（丹麥）檢查，耳聲發(fā)射檢測(cè)應(yīng)用Madsen CAPELLA（丹麥）進(jìn)行耳蝸外毛細(xì)胞功能檢測(cè)，聽性腦干誘發(fā)電位潛伏期及閾值檢測(cè)應(yīng)用Intelligent Hearing Systems SmartEP（美國(guó)）對(duì)聽神經(jīng)通路進(jìn)行評(píng)估。此外，還進(jìn)行了頭顱和顳骨CT、四肢X線檢查。

1.2.2 外周血DNA提取 抽取患兒及其父母的外周靜脈血，用試劑盒上海華舜生物工程有限公司提供提取法提取基因組DNA。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)與擴(kuò)增測(cè)序 TCOF1基因定位在5q32，該基因含有27個(gè)外顯子，共編碼1289個(gè)氨基酸，翻譯treacle蛋白。在目標(biāo)基因27外顯子的上、下游各50 bp內(nèi)含子序列區(qū)域設(shè)計(jì)相應(yīng)引物（上海英駿生物技術(shù)有限公司合成），對(duì)目的基因組DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增。用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction, PCR）檢測(cè)技術(shù)對(duì)TCOF1基因27個(gè)外顯子進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，直接測(cè)序。

1.2.4 TCOF1基因PCR檢測(cè)體系 見表1、圖1。

圖1 TCOF1基因擴(kuò)增PCR檢測(cè)反應(yīng)方案(每循環(huán)降0.5℃)

表1 TCOF1基因擴(kuò)增PCR檢測(cè)方案

2 結(jié)果

2.1 體檢結(jié)果

患兒精神狀態(tài)和營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)良好，全身體檢見：軀干和四肢發(fā)育正常、四肢活動(dòng)良好、顴骨、下頜骨發(fā)育稍差、雙下眼瞼向外下方低垂，雙耳廓發(fā)育基本正常、外耳道通暢、鼓膜完整、標(biāo)志清楚，對(duì)聲音反應(yīng)稍遲鈍。

2.2 聽力學(xué)及影像學(xué)檢查結(jié)果

2.2.1 聽力學(xué)檢查 聲導(dǎo)抗左耳“A”型、右耳“C”型測(cè)試曲線；腦干聽覺(jué)誘發(fā)電位潛伏期：雙耳Ⅲ、Ⅴ波潛伏期明顯延長(zhǎng)，左側(cè)V波潛伏期為8.63 ms，右側(cè)V波潛伏期為7.88 ms；腦干聽覺(jué)誘發(fā)電位雙耳閾值均為70 dB nHL；雙耳各頻率均未引出有意義的畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射。

2.2.2 影像學(xué)檢查結(jié)果 顳骨CT示雙側(cè)外耳道通暢，中耳、內(nèi)耳未見畸形；頭顱MRI示腦組織發(fā)育無(wú)異常；四肢X線均未見異常，見圖2。

圖2 患者一的顳骨CT

2.3 TCOF1基因突變篩查結(jié)果

TCOF1基因PCR后測(cè)序結(jié)果提示第2和24外顯子存在雜合突變，分別為c.146C>T和c.4169C>T，第1個(gè)突變位點(diǎn)將編碼的第49位異亮氨酸（I）轉(zhuǎn)變成了蘇氨酸（T）（見圖3）；第2個(gè)突變位點(diǎn)將編碼的第1390位丙氨酸（A）轉(zhuǎn)變成纈氨酸（V）（見圖4）?；純焊改概c其進(jìn)行比對(duì)分析，第2個(gè)外顯子未見突變，母親的第24個(gè)外顯子發(fā)現(xiàn)與患兒相同的突變位點(diǎn)（圖4-b、4-c）。在NCBI網(wǎng)站上對(duì)TCOF1基因單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）數(shù)據(jù)庫(kù)中篩查發(fā)現(xiàn)，第24個(gè)外顯子的c.4169C>T的雜合突變?yōu)镾NP，而第2個(gè)外顯子c.146C>T雜合突變未提示為SNP。

圖3 患兒和父母TCOF1基因第2個(gè)外顯子測(cè)序結(jié)果

圖4 患兒和父母TCOF1基因第24個(gè)外顯子測(cè)序結(jié)果

2.4 突變位點(diǎn)多物種保守性分析

用Clustal X軟件對(duì)TCOF1基因第2外顯子突變位點(diǎn)所處密碼子編碼的異亮氨酸在多物種間的保守性進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)其在不同進(jìn)化程度8個(gè)物種的同源基因所編碼蛋白質(zhì)序列高度保守（見圖5）。

圖5 多物種間氨基酸序列對(duì)比

3 討論

本研究來(lái)源于社區(qū)全科門診就診的一例顴骨和下頜骨發(fā)育不良、下眼瞼向外下方低垂、雙耳聽力篩查未通過(guò)患兒。就這一少見的綜合征患兒而言，首要工作是明確臨床診斷，根據(jù)患兒典型的臨床體征，首先考慮是與其表型相似的TCS[9]。該綜合征的致病基因是TCOF1（存在78%～93%的可能）[10]，基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)該基因的第2個(gè)外顯子出現(xiàn)了c.146C>T的突變位點(diǎn)，編碼的異亮氨酸（I）變成了蘇氨酸（T），進(jìn)行8個(gè)物種間的保守性分析發(fā)現(xiàn)第49位異亮氨酸高度保守。

TCOF1基因編碼核仁磷酸化蛋白Treacle[11]，該蛋白在胚胎發(fā)育期間在第一、二腮弓中高表達(dá)[12]。TCOF1基因突變會(huì)致使treacle蛋白功能不全而發(fā)生TCS[13]。Treacle蛋白在顱面部神經(jīng)嵴細(xì)胞發(fā)育時(shí)發(fā)揮重要作用，是胚胎發(fā)育過(guò)程中顱面部的關(guān)鍵蛋白，TCOF1基因突變使胚胎發(fā)育過(guò)程中神經(jīng)嵴細(xì)胞遷移產(chǎn)生第一、二腮弓發(fā)生畸形。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)嵴細(xì)胞和神經(jīng)上皮細(xì)胞的核糖體合成受阻是TCOF1基因突變導(dǎo)致第一二腮弓畸形的發(fā)生機(jī)制。Treacle蛋白是人類Nop65p核糖核蛋白復(fù)合物的組成成分和細(xì)胞核核糖體RNA前體形成早期的2’羥基甲基化相關(guān)聯(lián)[14，15]，在RNA的N-末端具有一個(gè)與核仁蛋白Lis1同源的超二級(jí)結(jié)構(gòu)LisH，與微管動(dòng)力學(xué)、染色體分離和細(xì)胞遷移相關(guān)[16，17]，因此判斷Treacle蛋白在核糖體生成過(guò)程中的某個(gè)特定階段發(fā)揮調(diào)控功能，這種調(diào)控功能發(fā)生于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)穿梭過(guò)程中，這一機(jī)制可因基因突變?cè)獾狡茐膶?dǎo)致TCS的發(fā)生，這可能就是TCOF1基因突變的發(fā)病機(jī)理。TCOF1基因突變小鼠的神經(jīng)外胚層及神經(jīng)嵴細(xì)胞內(nèi)成熟核糖體的量交野生型小鼠的量變少[18]，以此推斷，Treacle蛋白除定位細(xì)胞核的作用外，在神經(jīng)上皮活性調(diào)節(jié)、核糖體發(fā)育及神經(jīng)嵴細(xì)胞增殖上也發(fā)揮重要作用[18，14]，TCOF1基因單倍劑量不足可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)而致DNA損傷和神經(jīng)上皮細(xì)胞凋亡[19]。

TCS患者中有近50%出現(xiàn)傳導(dǎo)性聽力損失，主要為基因突變導(dǎo)致中耳腔發(fā)育不全及聽小骨畸形所致[20，21]，此外還存在雙側(cè)顴骨發(fā)育異常，可累及顳骨和上下頜骨，主要臨床表現(xiàn)見表2。TCS患者中出現(xiàn)外耳耳廓及小耳畸形的發(fā)生率為60.0%～80.9%不等[22，23]，其可分為不規(guī)則型、單側(cè)型、頓挫型、不完全型和完全型5種類型[24]。

通過(guò)患者的臨床表現(xiàn)、聽覺(jué)功能測(cè)試和影像學(xué)檢查結(jié)果對(duì)TCS的明確診斷提供參考價(jià)值。影像學(xué)檢查可發(fā)現(xiàn)表2中的各類骨性發(fā)育異常[25，26]。利用羊膜腔穿刺抽羊水進(jìn)行產(chǎn)前診斷可明確高度懷疑或已明確突變位點(diǎn)的家系懷孕成員攜帶致病基因情況，此外，孕檢超聲檢查也可對(duì)胎兒發(fā)育情況進(jìn)行初步判斷。TCS患者約有55%出現(xiàn)雙耳聽力損失，聽骨鏈缺如的純音聽閾測(cè)試結(jié)果多為平坦型傳導(dǎo)性損失的聽力曲線，而平坦型或斜坡型聽力曲線則多為聽骨鏈粘連或聽小骨發(fā)育不全所致。

表2 TCS常見的典型臨床癥狀

TCS治療原則為骨骼支架重建和軟組織修復(fù)。Trainor等[27]對(duì)TCS序貫治療進(jìn)行了總結(jié)報(bào)道，6歲以后可對(duì)耳廓發(fā)育異常的患兒行耳廓再造成形術(shù)，同樣對(duì)大于6歲中耳發(fā)育異?；純哼M(jìn)行人工聽骨植入，達(dá)到有效改善聽力損失的目的，針對(duì)這類患兒應(yīng)盡早配戴助聽器并進(jìn)行語(yǔ)言培訓(xùn)。下頜骨發(fā)育不良產(chǎn)生的小下頜畸形會(huì)產(chǎn)生口咽腔容積變小、舌后墜等異常，引起阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征，如存在明確的氣導(dǎo)狹窄影響呼吸應(yīng)盡早放置鼻咽通氣管或進(jìn)行氣管切開，并在6～10歲進(jìn)行頜骨成形手術(shù)，以緩解患兒阻塞性呼吸困難。Waitzman等[28]認(rèn)為最好在10歲后進(jìn)行顱眶顴骨重建，重建組織采用自體骨進(jìn)行整復(fù)。針對(duì)外眥形態(tài)異常、耳部和鼻部急性等軟組織缺損畸形，可根據(jù)異常程度擇期進(jìn)行整形修復(fù)，特征性的外眥角異?？缮弦仆獗{角并修復(fù)缺損眼瞼，盡可能修復(fù)到可接受的程度。

本研究旨在分析1例TCS患兒致病基因的突變位點(diǎn)，總結(jié)該病的臨床表現(xiàn)、發(fā)病機(jī)制及對(duì)診療方案，為該病開展精準(zhǔn)診斷、臨床治療提供依據(jù)。