陳長(zhǎng)興　仲衛(wèi)紅　金靈璐　李瑩瑩　鄭志煌　趙楠　付長(zhǎng)龍

①采用回流法制備烏頭湯藥物；②軟骨細(xì)胞培養(yǎng)、LPS誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞退變及Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色法進(jìn)行鑒定；③采用ELISA法檢測(cè)軟骨細(xì)胞上清液中一氧化氮（NO）與超氧化物歧化酶（SOD）水平變化；

④采用Western blot法檢測(cè)軟骨細(xì)胞中核因子NF-E2相關(guān)因子（Nrf2）、肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白（Keap1）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）蛋白含量表達(dá)。結(jié)果：①ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，與模型對(duì)照組比較，烏頭湯各濃度組中的NO水平下降（P < 0.01），而SOD水平明顯增高（P < 0.01）；②Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，烏頭湯組（150 ?g·mL^-1）對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞干預(yù)24 h后，可顯著改善軟骨細(xì)胞中Nrf2、Keap1、iNOS含量表達(dá)（P < 0.01）。結(jié)論：烏頭湯可抑制膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，其作用機(jī)制與調(diào)控Nrf2/Keap1途徑相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 膝骨關(guān)節(jié)炎；烏頭湯；軟骨細(xì)胞；氧化應(yīng)激反應(yīng)；大鼠

Study on the Inhibitory Effect of Wutou Tang（烏頭湯）on Oxidative Stress Response of Chondrocytes in Knee Osteoarthritis

CHEN Chang-xing，ZHONG Wei-hong，JIN Ling-lu，LI Ying-ying，ZHENG Zhi-huang，ZHAO Nan，F(xiàn)U Chang-long

【ABSTRACT】Objective：To investigate the pathway and mechanism of Wutou Tang（烏頭湯）in inhibiting oxidative stress response of chondrocytes in knee osteoarthritis.Methods：①Wutou Tang was prepared by reflux method;②Chondrocytes were cultured，LPS induced chondrocyte degeneration was made and typeⅡcollagen immunohistochemical staining was used for identification;③The levels of NO and SOD in the supernatant of chondrocytes were detected by ELISA;④Western blot was used to detect the expressions of Nrf2，Keap1 and iNOS in chondrocytes.Results：①The results of ELISA showed that compared with the model group，the level of NO in each concentration group of Wutou Tang decreased（P < 0.01），while the level of SOD increased significantly（P < 0.01）;②Western blot results showed that Wutou Tang group（150 ?g·mL^-1）could significantly improve the expression of Nrf2，Keap1 and iNOS in chondrocytes after 24 h of intervention on lipopolysaccharide induced chondrocytes（P < 0.01）.Conclusion：Wutou Tang can inhibit the oxidative stress response of chondrocytes in knee osteoarthritis，and its mechanism is related to the pathway of regulating?Nrf2/Keap1.

【Keywords】 knee osteoarthritis;Wutou Tang（烏頭湯）;chondrocytes;oxidative stress reaction;rats

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種在異常生物學(xué)及力學(xué)等多因素疊加影響下，可引起包括關(guān)節(jié)軟骨、滑膜、軟骨下骨結(jié)構(gòu)與功能正常偶聯(lián)失衡的關(guān)節(jié)疾病［1-2］。KOA好發(fā)于中老年人群，其臨床癥狀（疼痛、關(guān)節(jié)活動(dòng)不利等）嚴(yán)重影響中老年人的生活質(zhì)量，因此，對(duì)其防治具有重要意義［3］。KOA屬中醫(yī)學(xué)“膝骨痹”范疇，恰如《素問(wèn)·痹論篇》記載：“所謂痹者，各以其時(shí)，重感于風(fēng)寒濕之氣也?！惫蕦?duì)膝骨痹的施治宜行扶正祛邪、祛寒除濕、溫經(jīng)通絡(luò)之法［4］。

烏頭湯出自《金匱要略》，是臨床治療膝骨痹的常用經(jīng)方，具有扶正祛邪、祛寒除濕、利達(dá)關(guān)節(jié)之效，被中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)風(fēng)濕病分會(huì)發(fā)布的《骨關(guān)節(jié)炎病證結(jié)合診療指南》列為強(qiáng)推薦［5］。諸多研究表明，軟骨細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)是加劇KOA軟骨損傷的重要事件，而與氧化應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)的核因子NF-E2相關(guān)因子（Nrf2）/肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白（Keap1）Nrf2/Keap1信號(hào)途徑及一氧化氮（NO）與超氧化物歧化酶（SOD）調(diào)節(jié)因子的水平變化在KOA軟骨退變病理進(jìn)程中扮演了重要角色［6-7］。課題組前期通過(guò)計(jì)算機(jī)（網(wǎng)絡(luò)）模擬分析發(fā)現(xiàn)，烏頭湯可靶向作用于誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）等信號(hào)分子及關(guān)聯(lián)途徑，發(fā)揮抗氧化作用［8］，為進(jìn)一步驗(yàn)證并闡明其治療機(jī)制。本研究擬從Nrf2/Keap1信號(hào)途徑為切入點(diǎn)，探討烏頭湯抑制KOA軟骨細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠25只，雄性，4周齡，體質(zhì)量（90±5）g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證SCXK（滬）2017-0005。飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，恒溫25 ℃，濕度55%～60%。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證SYXK（閩）2019-0007。以上大鼠用于體外軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 烏頭湯（藥物組成：制川烏6 g，麻黃、黃芪、白芍、炙甘草各9 g）由福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三人民醫(yī)院提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 磷酸鹽緩沖液（批號(hào)ZNF1159，HyClone）；DMEM/LOW GLUCOSE（批號(hào)NZE1151，HyClone）；PageRuler（批號(hào)00156179，Thermo）；1-StepTM Transfer Buffer（批號(hào)PA196400，Thermo）；Nrf2（批號(hào)00083622，Proteintech Group，Inc）、Keap1（批號(hào)00084319，Proteintech Group，Inc）、iNOS（批號(hào)00080373，Proteintech Group，Inc），GAPDH（批號(hào)9306，Signal way Antibody LLC）等；Western blot凝膠成像系統(tǒng)（型號(hào)GELDOC 2000，美國(guó)BIO-RAD）等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 藥物準(zhǔn)備及軟骨細(xì)胞的培養(yǎng) 烏頭湯藥材經(jīng)浸泡后，再依次經(jīng)水回流、抽濾、濃縮、過(guò)濾等步驟，配成烏頭湯母液（10 mg·mL^-1），放置低溫下儲(chǔ)存。實(shí)驗(yàn)大鼠經(jīng)麻醉（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的異氟醚）成功后，依次清洗、剝離膝關(guān)節(jié)，分離與收集大鼠膝關(guān)節(jié)處軟骨組織。經(jīng)多次漂洗（PBS）后，進(jìn)行修塊、PBS反復(fù)洗凈、消化（質(zhì)量分順為0.2%的Ⅱ型膠原酶）、收集、吹洗、鋪板、傳代等步驟，進(jìn)行軟骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)（具體步驟參照課題組前期研

究）［9］。本實(shí)驗(yàn)使用第2代軟骨細(xì)胞。

2.2 軟骨細(xì)胞退變模型的復(fù)制 參照課題組前期方式復(fù)制軟骨細(xì)胞退變模型（LPS 10 ng·mL^-1，干預(yù)8 h）［9］。具體步驟如下：將第2代軟骨細(xì)胞的重懸液（計(jì)數(shù)2500個(gè)·mL^-1）種植于培養(yǎng)瓶中央；加入軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基后，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵育；待細(xì)胞鋪滿至90%空間時(shí)，移入10 ng·mL^-1LPS干預(yù)軟骨細(xì)胞8 h，制備軟骨細(xì)胞退變模型。

2.3 Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色法鑒定 Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色：依次經(jīng)PBS漂洗、固定（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的中性多聚甲醛）、再漂洗、裂解（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的破膜劑）、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的H2O2孵育、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的BSA封閉；陽(yáng)性對(duì)照組置于含Ⅱ型膠原一抗（1∶200）中進(jìn)行孵化過(guò)夜；陰性對(duì)照組用PBS代替，漂洗后加入

二抗（羊抗兔1∶200）反應(yīng)30 min；再經(jīng)DAB溶液浸潤(rùn)反應(yīng)10 min，蘇木素復(fù)染、返藍(lán)、常溫晾干，后依次經(jīng)脫水、梯度二甲苯完成透明，待封固（中性樹(shù)脂）后進(jìn)行鏡下觀察。

2.4 ELISA檢測(cè)軟骨細(xì)胞上清液NO與SOD水平變化 使用6孔板接種及孵育軟骨細(xì)胞，待爬片后，進(jìn)行分組與干預(yù)，分組：空白對(duì)照組、模型對(duì)照組（LPS誘導(dǎo)8 h后更換含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清DMEM繼續(xù)培養(yǎng)）、烏頭湯組（LPS誘導(dǎo)8 h后，更換0，50，100，150，200，400，600 ?g·mL^-1的WTD進(jìn)行后續(xù)干預(yù)24 h）。待干預(yù)完成后，參照ELISA試劑盒步驟，進(jìn)行NO與SOD水平檢測(cè)。

2.5 Western blot檢測(cè)Nrf2、Keap1、iNOS蛋白含量表達(dá) 提取其總蛋白成分，進(jìn)行BCA濃度分析；先配制體積分?jǐn)?shù)為12%的下層膠（分離膠），利用蒸餾水重力施壓膠面確保同水平面后，待其凝固后吸凈上層蒸餾水，再配體積分?jǐn)?shù)為5%的上層膠（濃縮膠）予以灌板，迅速插入梳子，待完全凝固后拔出梳子備用；操作移液槍以每孔20 μg進(jìn)行上樣，后依次經(jīng)電泳（前10 min調(diào)20 V電壓，再30 min調(diào)50 V，后100 V跑至膠底）、轉(zhuǎn)膜（電流為1.3 A、電壓25 V）、封閉后，再將各條膜置于預(yù)先配置好的Nrf2、Keap1、iNOS的一抗中，

4 ℃條件下均勻震蕩過(guò)夜；經(jīng)二抗反應(yīng)完成后，進(jìn)行顯影、成像、分析結(jié)果。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，采用t檢驗(yàn)與單因素方差分析進(jìn)行組間比較。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 軟骨細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定結(jié)果 第2代軟骨細(xì)胞在鏡下視野中排列緊致，大小一致，胞體充實(shí)飽滿，見(jiàn)圖1（1）。軟骨細(xì)胞經(jīng)Ⅱ型膠原染料浸染后，陽(yáng)性對(duì)照組胞漿區(qū)浸染為棕黃色，見(jiàn)圖1（2）。陰性對(duì)照組胞漿區(qū)則呈透明狀，見(jiàn)圖1（3）。

3.2 ELISA檢測(cè)結(jié)果 與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組、烏頭湯各濃度組NO水平升高（P < 0.01），SOD水平則明顯降低（P < 0.01）。與模型對(duì)照組比較，烏頭湯各濃度組NO水平降低（P < 0.01），SOD水平升高（P < 0.01）。見(jiàn)表1。

3.3 Western blot檢測(cè)軟骨細(xì)胞中Nrf2、Keap1、iNOS蛋白含量比較 與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組Keap1、iNOS蛋白含量表達(dá)顯著增高（P < 0.01），Nrf2蛋白含量表達(dá)呈降低趨勢(shì)（P < 0.01）；與模型對(duì)照組比較，烏頭湯150 ?g·mL^-1組的Keap1、iNOS蛋白含量表達(dá)顯著降低（P < 0.01），且Nrf2蛋白含量表達(dá)上調(diào)（P < 0.01）。

見(jiàn)表2。提示烏頭湯可調(diào)節(jié)Nrf2/Keap1途徑，發(fā)揮抗氧化作用，延緩其退變進(jìn)程。各組軟骨細(xì)胞中Nrf2、Keap1、iNOS蛋白電泳圖，見(jiàn)圖2。

4 討 論

KOA主要病因?yàn)橄リP(guān)節(jié)處關(guān)節(jié)軟骨的異常退變，而關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)則可加劇KOA的病理進(jìn)程［10］。研究表明，KOA發(fā)生后，伴隨炎癥反應(yīng)的放大與升級(jí)，可加速iNOS的激活，且活化的iNOS可經(jīng)結(jié)合反應(yīng)（與精氨酸）促使NO的生成，而異常升高的NO可進(jìn)一步通過(guò)致?lián)p作用（細(xì)胞毒或凋亡）加劇軟骨細(xì)胞退變［11-12］。SOD可發(fā)揮拮抗或清除氧自由基作用，減輕炎癥反應(yīng)程度，從而保護(hù)軟骨細(xì)胞免受過(guò)氧化作用的損害［13-14］。隨著對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)與軟骨細(xì)胞退變之間作用關(guān)系的深入研究，發(fā)現(xiàn)Nrf2/Keap1信號(hào)途徑可參與氧化應(yīng)激反應(yīng)，并對(duì)KOA軟骨細(xì)胞退變的調(diào)控產(chǎn)生重要影響［15-16］。正常生理?xiàng)l件下，Nrf2可偶聯(lián)Keap1共生于軟骨細(xì)胞質(zhì)中并經(jīng)泛素化降解，而一旦受到異常氧自由基（NO等）及致炎因子（LPS等）刺激，原來(lái)的Nrf2與Keap1結(jié)合態(tài)發(fā)生解離，進(jìn)一步誘使Nrf2產(chǎn)生活化效應(yīng)并移于細(xì)胞核與抗氧化元件（ARE）結(jié)合，產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄效應(yīng)，從而降低異常氧化應(yīng)激物質(zhì)的聚集，發(fā)揮清除氧自由基作用［17］。簡(jiǎn)言之，KOA發(fā)生后，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞異常表達(dá)iNOS，活化的iNOS促使NO的釋放，而NO作為活性氧的重要介質(zhì)之一，可促使Nrf2與Keap1發(fā)生解離，進(jìn)而激活Nrf2/Keap1信號(hào)途徑。

本研究結(jié)果顯示，烏頭湯可降低LPS誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中iNOS異常表達(dá)，改善軟骨細(xì)胞中NO與SOD水平，進(jìn)而調(diào)控Nrf2/Keap1信號(hào)途徑，在一定程度上發(fā)揮抗氧化作用，這亦與課題組前期網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果一致。此外，經(jīng)Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，烏頭湯（150 ?g·mL^-1）作用于軟骨細(xì)胞（LPS誘導(dǎo)）后，可改善退變軟骨細(xì)胞中異常表達(dá)的Keap1、Nrf2、iNOS的蛋白含量，推測(cè)烏頭湯通過(guò)降低LPS誘導(dǎo)的退變軟骨細(xì)胞中NO水平，升高SOD水平，且激活Nrf2/Keap1信號(hào)途徑中的關(guān)聯(lián)調(diào)節(jié)因子，發(fā)揮抗氧化作用。結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，即烏頭湯（150 ?g·mL^-1）通過(guò)降低LPS誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中炎癥反應(yīng)（NF-κB途徑）［9］，進(jìn)而豐富與詮釋了烏頭湯可減輕KOA患者的關(guān)節(jié)疼痛程度，提高Lysholm膝關(guān)節(jié)功能評(píng)分，改善并提高膝關(guān)節(jié)活動(dòng)度的作用機(jī)制［18］，為闡明烏頭湯治療KOA的效用機(jī)制并為臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)?？傊?，烏頭湯可抑制KOA軟骨細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，其作用機(jī)制與調(diào)控Nrf2/Keap1途徑相關(guān)。

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