張舸 張宏 劉楊 李德國(guó)

摘要：依據(jù)GB 5009.28—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測(cè)定》，采用高效液相色譜法，對(duì)焙烤食品中的苯甲酸、山梨酸和糖精鈉含量進(jìn)行同時(shí)測(cè)定。焙烤食品樣品被制備成粉末后，經(jīng)正己烷脫脂、水浴超聲提取、沉淀劑沉淀脫蛋白、離心等處理后，去除雜質(zhì)的溶液經(jīng)色譜柱分離紫外檢測(cè)器檢測(cè)后，根據(jù)保留時(shí)間定性，峰面積外標(biāo)法定量。結(jié)果顯示：苯甲酸、山梨酸和糖精鈉3種被分析物，校準(zhǔn)曲線最佳線性范圍為0.5～100 mg/L，線性相關(guān)系數(shù)R均大于0.999 8，檢出限均為0.005 g/kg，樣品加標(biāo)回收率范圍90%～110%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）2%～8%。該方法具有線性關(guān)系良好、操作簡(jiǎn)單、快速準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，適用于焙烤食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的同時(shí)檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：苯甲酸；山梨酸；糖精鈉；高效液相色譜；焙烤食品

中圖分類(lèi)號(hào)：TS207.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20220420

Determination of Benzoic Acid Sorbic Acid and Saccharin Sodium in Baked Food by High Performance Liquid Chromatograhy

Zhang Ge1， Zhang Hong1， Liu Yang1， Li Deguo2

（ 1. Siping Product Quality Inspection Institute， Siping， Jilin 136000； 2. Gongzhuling Grain Bureau， Changchun， Jilin 136100 ）

Abstract： According to the national food safety standard for the determination of benzoic acid， sorbic acid and saccharin sodium in food （GB 5009.28—2016）， the contents of preservatives benzoic acid， sorbic acid and saccharin sodium in baked food were determined simultaneously by HPLC. After the baked food sample was prepared into powder， the sample treated with n-hexane degreasing， water bath ultrasound， precipitant protein precipitation， centrifugal clarification， etc. After removing impurities， the solution was separated by chromatographic column and detected by ultraviolet detector. Qualitatively according to retention time and quantitative by peak area external standard method. The results showed that the best linear range of calibration curve for benzoic acid， sorbic acid and saccharin sodium was 0.5 ～ 100 mg/L， the linear correlation coefficient R was greater than 0.999 8， the detection limit was 0.005 g/kg， the recovery range was 90% ～ 110%， and the relative standard deviation （RSD） was 2% ～ 8%. The results showed that the method has the advantages of good linear relationship， simple operation， rapid and accurate. It is suitable for the simultaneous determination of benzoic acid， sorbic acid and saccharin sodium in baked food.

Key words： benzoic acid， sorbic acid， saccharin sodium， high performance liquid chromatography， baked food

苯甲酸及其鈉鹽和山梨酸及其鉀鹽在酸性條件下，對(duì)霉菌、酵母菌和許多好氣菌均有抑制作用，是食品中常用的防腐劑。由于苯甲酸和山梨酸水溶性差，大多以苯甲酸鈉和山梨酸鉀的形式添加到食品中，食品中這兩種防腐劑的含量是以苯甲酸和山梨酸計(jì)。長(zhǎng)期過(guò)量食用苯甲酸，易發(fā)生蕁麻疹、哮喘及血管性水腫等一系列過(guò)敏癥狀。與苯甲酸相比，山梨酸毒性小，但防腐效果更好，被廣泛用于乳及乳制品、面包、糕點(diǎn)、餅干、果汁、果醬、醬醋菜和水產(chǎn)品等食品的防腐。糖精鈉即糖精是一種人工合成的甜味劑、增味劑，其甜度為蔗糖的200～300倍，但人過(guò)量攝入糖精會(huì)影響腸胃消化酶的正常分泌，降低小腸的吸收能力，使食欲減退，而且糖精鈉還有致畸、致癌和致遺傳損害的可能性[1]。

苯甲酸（鈉）、山梨酸（鉀）和糖精鈉因其價(jià)格低廉，在食品工業(yè)被廣泛使用。《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760—2014）規(guī)定：苯甲酸（鈉）和糖精鈉的使用范圍不包括焙烤食品，山梨酸（鉀）除了面包、糕點(diǎn)和餅干限量使用，其他的焙烤食品都不在使用范圍內(nèi)也只能限量使用。近年來(lái)，各地市場(chǎng)監(jiān)督監(jiān)督管理部門(mén)對(duì)糕點(diǎn)和餅干等焙烤食品抽檢結(jié)果顯示，苯甲酸（鈉）、山梨酸（鉀）和糖精鈉3種食品添加劑均有超范圍、超限量使用現(xiàn)象。不法生產(chǎn)企業(yè)、個(gè)人為了延長(zhǎng)產(chǎn)品保質(zhì)期和降低成本，在焙烤食品中超量使用山梨酸，違規(guī)使用苯甲酸和糖精鈉，侵害消費(fèi)者利益。因此，對(duì)焙烤食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測(cè)定十分重要。

苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的國(guó)標(biāo)測(cè)定方法中有氣相色譜法（GC）和高效液相色譜法（HPLC）。與HPLC法相比，GC法分離度和準(zhǔn)確度相對(duì)較差、操作復(fù)雜，且所用試劑乙醚毒性大，不利于檢驗(yàn)人員的身體健康[2]。因此，本研究采用高效液相色譜法，同時(shí)測(cè)定焙烤類(lèi)食品中的苯甲酸、山梨酸和糖精鈉，以期為食品安全檢測(cè)部門(mén)提供有效檢驗(yàn)方法及數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑材料

苯甲酸（GBW（E）100006）、山梨酸（GBW（E）100007）、糖精鈉（GBW（E）100008）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：1 000 mg/L，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院；甲醇（色譜級(jí)）：德國(guó)默克有限公司；焙烤食品陰性樣品：無(wú)任何添加劑的自制奶油蛋糕。

1.2 儀器設(shè)備

LC-20型高效液相色譜儀：配紫外檢測(cè)器，島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司；ME203型千分之一電子天平：梅特勒-托利多科技（中國(guó)）有限公司；KQ-500DE型超聲波發(fā)生器：昆山市超聲儀器有限公司；XW-80A型渦旋混合器：海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3 試劑配制

亞鐵氰化鉀溶液（92 g/L）：取26.5 g亞鐵氰化鉀，適量水溶解后，水定容至250 mL。

乙酸鋅溶液（183 g/L）：取55 g乙酸鋅少量水溶解后，加入30 mL冰乙酸，水定容至250 mL。

乙酸銨溶液（0.02 mol/L）：取1.54 g乙酸銨少量水溶解后，水定容至1 000 mL，0.22 μm水相濾膜過(guò)濾。臨用前配制脫氣。

氨水溶液（1+99）：氨水1 mL加99 mL水。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

混合標(biāo)準(zhǔn)中間液（100 mg/L）：分別準(zhǔn)確吸取質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的苯甲酸、山梨酸和糖精鈉（以糖精計(jì)）標(biāo)準(zhǔn)溶液各1 mL，用水定容至10 mL。

混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液：分別準(zhǔn)確吸取混合標(biāo)準(zhǔn)中間0.002、0.004、0.005、0.01、0.05、0.10、0.50、1.00 mL，用水定容至10 mL，配制成質(zhì)量濃度0.2、0.4、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液，臨用現(xiàn)配。

單標(biāo)溶液的配制：分別吸取質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的苯甲酸、山梨酸和糖精鈉（以糖精計(jì)）標(biāo)準(zhǔn)溶液各0.5 mL，分別用水定容至10 mL，配制成質(zhì)量濃度為50.0 mg/L的單標(biāo)溶液。

1.5 色譜分析條件

色譜柱：C18柱，250 mm×4.6 mm×5 μm；流動(dòng)相：A為20 mmol/L乙酸銨，B為甲醇，VA∶VB=95∶5；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：25 ℃；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm。

1.6 樣品前處理

試樣制備：將樣品中半固態(tài)樣品部分用組織勻漿機(jī)勻漿，固體樣品部分用研磨機(jī)粉碎，攪拌均勻后，倒入組織勻漿機(jī)中和前者一起攪拌均勻。

試樣提?。悍Q(chēng)取2.000 g樣品于50 mL離心管中，加10 mL正己烷，60 ℃水浴加熱5 min，不時(shí)輕搖，待脂肪溶解后，加25 mL氨水溶液（1+99），1 mL乙醇，渦旋混勻，50 ℃水浴超聲20 min，冷卻至室溫后，再加入2.0 mL飽和硼砂溶液，搖勻后，加入2.0 mL亞鐵氰化鉀溶液、2.0 mL乙酸鋅溶液，混勻，8 000 r/min離心5 min，棄去有機(jī)相，水相轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，殘?jiān)?0 mL水，渦旋混勻后50 ℃超聲5 min，8 000 r/min離心5 min，棄去有機(jī)相，水相轉(zhuǎn)移至同一50 mL離心管中，取適量上清液過(guò)0.22 μm濾膜，作為待測(cè)液。

1.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

按照1.5的色譜分析條件，將混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液從低濃度到高濃度進(jìn)行測(cè)定，記錄保留時(shí)間和峰面積，每個(gè)濃度重復(fù)進(jìn)樣2次，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制3種分析物的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜分析條件及樣品前處理方法的選擇

2.1.1 紫外檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

選擇最佳波長(zhǎng)對(duì)于提高檢測(cè)結(jié)果的精確度和靈敏度具有重要意義[3]。將山梨酸、苯甲酸和糖精鈉的標(biāo)準(zhǔn)樣品在200～300 nm檢測(cè)波長(zhǎng)處進(jìn)行掃描，它們的最大吸收波長(zhǎng)分別為254 、223 、202 nm，3種物質(zhì)在230 nm附近均具有理想吸收，故選用230 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.1.2 流動(dòng)相的選擇

甲醇可以改變流動(dòng)相的極性，流動(dòng)相的配比能改變組分分離情況，改善峰型，提高分離度[4]。固定其他實(shí)驗(yàn)條件，選擇質(zhì)量濃度為10.0 mg/L的混標(biāo)，在流動(dòng)相配比（VA∶VB）分別為90∶10、93∶7、95∶5下進(jìn)行分析，觀察3種被分析物的分離度和出峰時(shí)間。結(jié)果表明：隨著甲醇在流動(dòng)相中比例的增大，分離度減少，出峰時(shí)間縮短，在VA∶VB為95∶5時(shí)，3種被分析物的分離效果和峰型均較好，在18 min內(nèi)能夠完成苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的分析。所以選擇體積比為95∶5的乙酸銨（0.02 mol/L）—甲醇混合液作為流動(dòng)相。

2.1.3 沉淀劑的選擇

常用的蛋白質(zhì)沉淀劑有硫酸鋅、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、硫酸銅、氫氧化鈉等，選用106 g/L的亞鐵氰化鉀溶液和220 g/L的乙酸鋅溶液各2.0 mL時(shí)，處理液沉淀明顯，上清液清晰，可以最大限度地去除雜質(zhì)，滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)要求[5-7]。

2.2 苯甲酸、山梨酸、糖精鈉定性及定量分析

按照1.5的色譜分析條件，先將10.0 mg/L的混標(biāo)進(jìn)樣分析，再將單標(biāo)質(zhì)量濃度為50.0 mg/L的3種被分析物分別進(jìn)樣，根據(jù)它們的保留時(shí)間，確定3種物質(zhì)，色譜圖見(jiàn)圖1。

由圖1可知，苯甲酸、山梨酸、糖精鈉獲得了良好的分離且互不干擾測(cè)定，樣品干擾少，峰形好。3種物質(zhì)的保留時(shí)間分別為9.679、13.590、17.723 min。

將試樣待測(cè)液注入液相色譜儀中，得到峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測(cè)液中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉 （以糖精計(jì)）的質(zhì)量濃度。

2.3 方法的線性關(guān)系

3種被分析物的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表1。

結(jié)果表明：苯甲酸和山梨酸在0.2～100 mg/L范圍內(nèi)，糖精鈉在0.5～100 mg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)R均大于0.999 8，符合《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》（GB/T 27404—2008）附錄F的要求。

2.4 檢出限測(cè)定

利用液相色譜相關(guān)軟件計(jì)算檢出限，以3倍信噪比（S/N=3）對(duì)應(yīng)的濃度為檢出限。在取樣量2 g，定容50 mL時(shí)，苯甲酸、山梨酸和糖精鈉（以糖精計(jì)）的檢出限均為0.005 g/kg。

2.5 準(zhǔn)確性和可靠性

2.5.1 加標(biāo)回收率和方法重復(fù)性測(cè)定

選擇方法測(cè)定底限、在糧食中的殘留量限量和任選一點(diǎn)3個(gè)水平，在陰性樣品中同時(shí)添加苯甲酸、山梨酸和糖精鈉，按照1.5色譜條件每個(gè)水平進(jìn)行6次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，添加濃度、檢測(cè)結(jié)果及方法重復(fù)性（RSD）測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

2.5.2 儀器重復(fù)性測(cè)定

選擇1、40 mg/L兩個(gè)質(zhì)量濃度的苯甲酸、山梨酸和糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)混合液注入色譜儀，在1.5色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算RSD值，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

從表2和表3可以看出，本方法三水平添加苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的回收率在90%～110%，方法和儀器重復(fù)性測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在2%～8%。說(shuō)明該方法檢測(cè)的準(zhǔn)確性和可靠性良好，符合《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》（GB/ T 27404—2008）要求。

3 結(jié) 論

選用正己烷、氨水—乙醇溶液、乙酸鋅、亞鐵氰化鉀、硼砂去除脂肪和蛋白質(zhì)等大分子雜質(zhì)，樣品處理液的上層液澄清，上層液能順利通過(guò)濾膜，此樣品處理方法不僅干擾少、峰形好，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，還可以降低柱壓、減少色譜柱的污染，延長(zhǎng)其使用壽命。使用本方法要注意的是：標(biāo)準(zhǔn)溶液應(yīng)選用有效期內(nèi)的；苯甲酸、山梨酸和糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)工作液容易降解，不能放置過(guò)久，宜現(xiàn)配現(xiàn)用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本方法具有線性關(guān)系、準(zhǔn)確性、精密度好，出峰時(shí)間快、峰形好、分離度好等優(yōu)點(diǎn)，適用于烘焙食品中的苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的同時(shí)測(cè)定。

參 考 文 獻(xiàn)

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