杜靜怡?王鋮?郭君慧?謝浩

摘要：細(xì)菌RND（resistance-nodulation-cell division）外排泵是一類由內(nèi)膜轉(zhuǎn)運蛋白、周質(zhì)融合蛋白、外膜外排蛋白組成的蛋白復(fù)合體，能夠?qū)⒖咕幬锖投喾N小分子化合物如毒素、染料、洗滌劑、脂質(zhì)、群感信號分子等排出細(xì)菌細(xì)胞外。通過影響RND外排泵的組裝和功能，可逆轉(zhuǎn)多重耐藥性的發(fā)生與防止耐藥性的發(fā)展。細(xì)菌具有多種外排泵，本文以RND外排泵為代表，介紹與其結(jié)構(gòu)以及外排藥物的轉(zhuǎn)運和調(diào)控機制的最新進(jìn)展。

關(guān)鍵詞：RND外排泵；細(xì)菌耐藥性；蛋白復(fù)合體結(jié)構(gòu)；調(diào)控機制

中圖分類號：Q735? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Research progress in the structure and function of RND efflux pump

Du Jing-yi， Wang Chen， Guo Jun-hui， and Xie Hao

（School of Chemistry， Chemical Engineering， and Life Science， Wuhan 430070）

Abstract RND （resistance-nodulation-cell division） efflux pump consists of inner membrane protein， periplasmic membrane fusion protein， and outer membrane protein. It pumps out a wide spectrum of antibiotics and leads to development of multi-drug resistance of host cells. Substrates of RND efflux pump are not limited to antibiotics， but also small molecules such as toxins， dyes， lipids， and quorum sensing signals. Due to the importance of RND efflux pump in multi-drug resistance， one can affect and inhibit the assembly and function of RND efflux pump to prevent and/or reserve multidrug resistance. In this article， the important and latest research progress of the structure as well as the transportation and regulation mechanism of representative RND efflux pumps is reviewed.

Key words RND efflux pump; Antimicrobial resistance; Protein structure; Regulation mechanism

在過去的20年中，多重耐藥細(xì)菌的種類、數(shù)量在快速增加，危害性也日益增強，例如每年美國有高達(dá)6.3萬人因感染“超級耐藥細(xì)菌”而死亡，遠(yuǎn)超過感染艾滋病毒的死亡人數(shù)[1]。世界衛(wèi)生組織的全球監(jiān)測報告指出，如果不能有效遏制“超級細(xì)菌”在全球范圍的擴(kuò)散，由此造成的死亡人數(shù)每年超過10萬人[1]。但是新的抗菌藥物的研發(fā)緩慢，遠(yuǎn)遠(yuǎn)跟不上耐藥細(xì)菌出現(xiàn)的速度。因此，迫切需要了解細(xì)菌耐藥機制，尋找新的治療方法來對抗耐藥細(xì)菌。

目前的研究表明，細(xì)菌主要通過5種機制（表1）產(chǎn)生耐藥性[2-10]，分別為：①產(chǎn)生抗菌藥物滅活酶，②干擾抗菌藥物的作用靶位，③降低細(xì)胞膜對抗菌藥物的通透性，④主動外排抗菌藥物，⑤形成生物被膜。

藥物外排泵是位于細(xì)胞膜上的蛋白復(fù)合體，可以幫助細(xì)菌將抗菌藥物排出細(xì)胞，降低其在細(xì)胞內(nèi)的濃度，在臨床中導(dǎo)致病原體對抗菌藥物表現(xiàn)出耐藥性[11]。在細(xì)菌中，主要有5類外排泵[12-13]，分別是MFS家族（major facilitator superfamily）[14]、ABC家族（ATP-binding cassette superfamily）[15]、MATE家族（multidrug and toxic compound extrusion superfamily）[16]、RND家族（resistance-nodulation-cell division superfamily）[17]和SMR家族（small multidrug resistance superfamily）[18]。其中，RND外排泵使革蘭陰性菌具有內(nèi)源耐藥性，相關(guān)的感染更加難以治療[19-20]。本文將介紹與細(xì)菌RND外排泵相關(guān)的研究進(jìn)展，主要包括RND家族成員分布、結(jié)構(gòu)特點、轉(zhuǎn)運機制、相關(guān)及潛在應(yīng)用，從而為基于RND外排泵的新型抗耐藥小分子藥物研發(fā)提供指導(dǎo)。

1 RND家族成員分布

RND蛋白家族廣泛存在于細(xì)菌、古生菌和真核生物（圖1），RND蛋白所組成的外排泵系統(tǒng)主要包括內(nèi)膜蛋白、周質(zhì)膜融合蛋白、外膜蛋白3個部分，能夠介導(dǎo)多種小分子如抗菌藥物、疏水性染料和洗滌劑的跨膜運輸[21]。以下是來源于不同菌種的幾種代表性的RND外排泵結(jié)構(gòu)及其底物（表2）。

沙雷菌（Serratia marcescens）有8種RND外排泵[22]。其中，SdeCDE系統(tǒng)含有兩個內(nèi)膜蛋白，SdeS系統(tǒng)缺少周質(zhì)膜融合蛋白。含有周質(zhì)膜融合蛋白的RND外排泵具有更加廣泛的底物范圍，在內(nèi)源性多重耐藥機制中具有重要意義[23]。而缺乏周質(zhì)膜融合蛋白的RND外排泵的底物范圍狹窄，例如SdeS系統(tǒng)只外排紅霉素、新生霉素、SDS和脫氧膽酸[22]。

大腸埃希菌（Escherichia coli）至少有7種RND外排泵，可以分為疏水/兩親性RND外排泵和重金屬RND外排泵兩類，分別外排疏水/兩親性抗菌藥物和有毒金屬離子[24-26]。在疏水/兩親性RND外排泵中，AcrAB-TolC系統(tǒng)與大腸埃希菌天然固有耐藥性相關(guān)[27]。AcrAB-TolC系統(tǒng)的編碼基因為acrAB和tolC，由轉(zhuǎn)錄激活因子RamA、SoxS、MarA和Rob調(diào)控表達(dá)。在環(huán)境脅迫下，相關(guān)轉(zhuǎn)錄激活因子解除抑制，結(jié)合到acrAB啟動子區(qū)域，激活表達(dá)[28]。

鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii）有7種RND外排泵。其中，最常見的是AdeABC系統(tǒng)、AdeIJK系統(tǒng)和AdeFGH系統(tǒng)[29]。AdeABC系統(tǒng)和AdeFGH系統(tǒng)與獲得性耐藥相關(guān)，過表達(dá)時導(dǎo)致多重耐藥；AdelJK系統(tǒng)與天然耐藥相關(guān)。AdeABC系統(tǒng)過表達(dá)可造成β-內(nèi)酰胺類等的外排而導(dǎo)致藥物耐受，而對氨基糖苷或氟喹諾酮的影響可以忽略不計[30]。AdeIJK系統(tǒng)中的adeJ表達(dá)水平提高可外排哌拉西林、美羅培南、亞胺培南、替加環(huán)素、頭孢他啶、頭孢噻肟和環(huán)丙沙星等而導(dǎo)致多重耐藥[31]。AdeFGH系統(tǒng)過表達(dá)與抗菌藥物耐藥性以及生物膜形成關(guān)系不大[32]。

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）有12種RND外排泵，其中MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN、MexXY-OprM在臨床耐藥菌株中最為常見[33-34]。MexAB-OprM、MexCD-OprJ和MexXY-OprM屬于負(fù)調(diào)節(jié)表達(dá)，分別受調(diào)控基因nalD、nalC、mexR、nfxB和mexZ調(diào)控相關(guān)操縱子的表達(dá)。而MexEF-OprN屬于正調(diào)節(jié)表達(dá)，受正調(diào)節(jié)蛋白MexT調(diào)控。MexAB-OprM系統(tǒng)是外排氧氟沙星的主要系統(tǒng)，MexXY-OprA系統(tǒng)是缺乏MexAB的突變體外排氧氟沙星的代用系統(tǒng)，而MexCD-OprJ和MexEF-OprN系統(tǒng)的高水平表達(dá)與左氧氟沙星、氟喹諾酮耐藥相關(guān)[35]。另外，mexB、mexC和mexY基因的過表達(dá)導(dǎo)致銅綠假單胞菌的多重耐藥性[33]。

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）中，目前已報道的RND外排泵有6種，分別是AcrAB、KexD、OqxAB、EefABC、KexEF和KexC。AcrAB外排泵可外排各類抗菌藥物，如氟喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、氯霉素和四環(huán)素類。其調(diào)節(jié)因子RamA突變可導(dǎo)致AcrAB過表達(dá)，從而降低肺炎克雷伯菌對替加環(huán)素的耐藥性[36-38]。OqxAB介導(dǎo)肺炎克雷伯菌對喹諾酮類、氯霉素、喹乙醇和替加環(huán)素等多種抗菌素的耐藥性，受到調(diào)節(jié)因子RamA和RarA的調(diào)控[39-40]。

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一種輕度嗜鹽的革蘭陰性細(xì)菌，可導(dǎo)致食物中毒，主要有12種RND外排泵。其中，VmeAB是導(dǎo)致鄰氯青霉素等藥物抗性的主要原因，在主動外排膽汁酸過程中也起到重要作用[41]。副溶血性弧菌中的其他RND外排泵與VmeAB類似。其中的VmeCD、VmeEF、VmeYZ分別與VpoC共表達(dá)，可以使副溶血性弧菌提高外排底物的種類和范圍。

霍亂弧菌（Vibrio cholerae）中已報道的RND外排泵有6種。其中，VexEF外排泵系統(tǒng)具有廣泛的底物范圍[42]，VexCD外排泵的底物范圍較窄，與VexAB基本一致。

通過比較不同細(xì)菌的RND外排泵，可以發(fā)現(xiàn)這些RND外排泵具有以下共同特征。①RND外排泵對廣譜的藥物外排特性，而含有周質(zhì)膜融合蛋白的RND周質(zhì)膜融合蛋白，具有更廣泛的外排藥物范圍。②RND外排泵的底物與來源菌種的生存環(huán)境有密切關(guān)系，例如大腸埃希菌中的AcrAB-TolC外排泵系統(tǒng)的主要底物是腸道中的多種膽酸鹽，副溶血性弧菌的VmeEF-VpoC和VmeYZ-VpoC復(fù)合體的主要底物是十二指腸中的膽汁酸。

2 RND外排泵的結(jié)構(gòu)及轉(zhuǎn)運機制

RND外排泵主要是內(nèi)膜轉(zhuǎn)運蛋白、周質(zhì)融合蛋白、外膜外排蛋白組成的蛋白復(fù)合體（圖2A），其結(jié)構(gòu)信息主要來自對大腸埃希菌和銅綠假單胞菌的AcrAB-TolC和MexAB-OprM的研究[28]。這兩個復(fù)合體是目前理解RND外排泵機制的結(jié)構(gòu)和功能模型，二者的內(nèi)膜蛋白AcrB與MexB具有86%的相似度，而且在功能上也有一定的相似性。

在AcrAB-TolC中，內(nèi)膜蛋白AcrB含有跨膜結(jié)構(gòu)域和胞漿結(jié)構(gòu)域，由AcrB亞基組成同源三聚體中存在3種構(gòu)象，即開放獲?。ㄋ缮⒌?，L）狀態(tài)，藥物結(jié)合（緊密的，T）狀態(tài)，和藥物排出（開放的，O）狀態(tài)，并通過不同構(gòu)象的循環(huán)改變實現(xiàn)藥物運輸[43]。從AcrB的周質(zhì)/外膜瓣通過周質(zhì)域的藥物外排途徑是許多研究的焦點。AcrB位于胞漿的底物結(jié)合位點包含一個淺（近端）結(jié)合袋和一個深（遠(yuǎn)端）結(jié)合袋，被殘基614-621組成的開關(guān)環(huán)分隔并影響底物的轉(zhuǎn)運[22]。當(dāng)開關(guān)環(huán)中側(cè)鏈基團(tuán)較小的甘氨酸殘基615突變?yōu)閭?cè)鏈基團(tuán)較大的殘基時，會影響大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物（如紅霉素）的轉(zhuǎn)運，但不會影響分子量較小化合物（如新生霉素、乙錠、氯霉素）的轉(zhuǎn)運活性[44]。因此，可以利用針對開關(guān)環(huán)的外排泵抑制劑，影響抗菌藥物的外排。Du等[28]構(gòu)建了外排泵四維結(jié)構(gòu)模型并揭示了TolC、AcrA和AcrBZ復(fù)合體的晶體連接結(jié)構(gòu)，通過低溫電磁圖和熱力學(xué)角度等研究證明，AcrA分別與AcrB和TolC在周質(zhì)中獨立橋接（圖2B）：①AcrA的α-發(fā)夾結(jié)構(gòu)與周質(zhì)中圓柱體的6個等效接觸面聯(lián)系整合，該結(jié)構(gòu)與TolC的α-螺旋結(jié)構(gòu)起到橋接作用；②AcrA的膜近端結(jié)構(gòu)域和β-桶狀結(jié)構(gòu)域與AcrB子域相互作用且形成封閉的周質(zhì)通道；③形成的通道結(jié)構(gòu)與AcrB或TolC都沒有相互作用。這些發(fā)現(xiàn)揭示了自然條件下AcrAB-TolC的結(jié)構(gòu)特點，證實了復(fù)合體以3：6：3的AcrB： AcrA： TolC比例組裝[45]。

MexAB-OprM系統(tǒng)的整體結(jié)構(gòu)是一個垂直拉長的棒狀結(jié)構(gòu)，OprM、MexA和MexB的化學(xué)計量比為1：2：1。MexA形成漏斗狀六聚體使MexB和OprM結(jié)合。在MexA的4個結(jié)構(gòu)域中：α-hairpin結(jié)構(gòu)域與OprM相互作用；β-barrel結(jié)構(gòu)域和MP結(jié)構(gòu)域與MexB相互作用；MexA的脂酰結(jié)構(gòu)域不與OprM、MexB相連，而是與β-barrel結(jié)構(gòu)域形成一個六聚環(huán)。Tsutsumi等[46]基于MexAB-OprM的結(jié)構(gòu)研究而構(gòu)建的底物轉(zhuǎn)運機制模型如下（圖3）：①6個MexA原聚體與MexB三聚體結(jié)合形成一個六聚體管；②封閉的OprM三聚體打開H3-H4螺旋與MexA六聚體相互作用；③H7-H8螺旋向外旋轉(zhuǎn)，被疏水相互作用固定在MexA的一側(cè)；④形成開放狀態(tài)的MexAB-OprM系統(tǒng)；⑤根據(jù)藥物濃度的不同，MexB中的靜息前聚體會改變其構(gòu)象，形成結(jié)合狀態(tài)；⑥藥物被帶入MexB，通過MexA-OprM管，然后根據(jù)濃度梯度將藥物排出細(xì)胞外。

3 RND外排泵的結(jié)構(gòu)和功能調(diào)控

3.1 RND外排泵結(jié)構(gòu)的組裝及調(diào)控

RND型外排泵的內(nèi)膜蛋白、周質(zhì)膜融合蛋白和外膜蛋白3個組件，需要正確的裝配在一起才能發(fā)揮作用。因此，干擾復(fù)合體的結(jié)構(gòu)裝配過程，可以對功能產(chǎn)生影響。在AcrAB-TolC系統(tǒng)中，AcrB與TolC之間沒有直接的作用，而是分別與AcrA發(fā)生作用[28]。低溫電子斷層掃描研究表明，AcrAB復(fù)合體通過改變其構(gòu)象募集TolC[47]，AcrB與底物結(jié)合時為AcrA六聚體的合成提供了基礎(chǔ)，以便于其與TolC的連接過程。這項研究也證實了天然環(huán)境下AcrA-AcrB-TolC的存在形式。肽聚糖在AcrAB-TolC的組裝過程中起重要作用，AcrA的α-發(fā)夾結(jié)構(gòu)域與肽聚糖結(jié)合有助于維持AcrAB復(fù)合體在細(xì)胞膜中的穩(wěn)定性，因此可以通過干擾AcrA與肽聚糖或AcrB之間的相互作用而阻斷AcrAB-TolC的結(jié)構(gòu)組裝。

MexAB-OprM是與大腸埃希菌AcrAB-TolC同源的系統(tǒng)。AcrB和MexB的氨基酸序列同源性為70%，AcrA和MexA的同源性為57%，TolC和OprM的同源性為19%[48]。在組裝過程中如果將MexB與AcrB互換時，可形成AcrA-MexB-TolC復(fù)合體，但與原復(fù)合體的形成相比發(fā)生率較低[49]，因此可能存在通用的機制觸發(fā)外排泵的組裝，形成效率取決于周質(zhì)膜融合蛋白的結(jié)合親和力?；谶@些發(fā)現(xiàn)，可通過阻止蛋白質(zhì)識別或阻礙其結(jié)構(gòu)適應(yīng)性影響外排泵系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)組裝，為研究外排泵抑制劑提供了思路。

3.2 RND外排泵基因的表達(dá)及調(diào)控

外排泵的表達(dá)調(diào)控涉及眾多基因和蛋白，它們以復(fù)雜的方式，構(gòu)成了多層次的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控系統(tǒng)。在MexAB-OprM和MexXY系統(tǒng)中，mexR、nalC和nalD基因參與調(diào)控MexAB-OprM系統(tǒng)，mexZ、armZ基因參與調(diào)控MexXY系統(tǒng)[50]。另外，MexZ通路、PA5471通路、AmgRS和ParRS通路也可誘MexXY表達(dá)，其中PA5471通路（圖4）研究較為清晰。對于ParRS系統(tǒng)而言[51]，ParR調(diào)控基因的作用位點，如外排蛋白MexXY （MexXY）編碼、多胺生物合成途徑PA4773-PA4774-PA4775等，與ParRS一起促進(jìn)了細(xì)菌的耐藥性。闡明外排泵基因的調(diào)控機制，研發(fā)相關(guān)抑制劑，阻斷調(diào)控通路，為逆轉(zhuǎn)耐藥性開辟了新前景。

RND外排泵基因在細(xì)菌內(nèi)過表達(dá)是細(xì)菌耐藥性形成的重要原因，而群體感應(yīng)系統(tǒng)對 RND外排泵基因表達(dá)的調(diào)控起到重要作用[20]。同時，RND外排泵通過外排群體感應(yīng)信號分子在群體感應(yīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。兩者之間存在互相依賴、互相制約的聯(lián)系[20]。一方面，群體感應(yīng)系統(tǒng)能夠調(diào)控RND外排泵基因的表達(dá)，例如以3-oxo-C12-HSL和C4-HSL作為群體感應(yīng)信號因子的相關(guān)試驗中，加入的群體感應(yīng)信號分子顯著地誘導(dǎo)外排泵基因表達(dá)，提高了菌株對相關(guān)抗菌藥物的抗性。另一方面，RND外排泵也能影響群體感應(yīng)系統(tǒng)，例如通過外排泵基因的過量表達(dá)而間接影響群體感應(yīng)系統(tǒng)信號合成基因的表達(dá)，從而進(jìn)一步通過群體感應(yīng)來降低毒性物質(zhì)的產(chǎn)量。因此，研究轉(zhuǎn)錄調(diào)控與群體感應(yīng)系統(tǒng)的相互關(guān)系，可能為解決含有RND蛋白細(xì)菌的耐藥性提供新思路。

3.3 RND外排泵抑制劑的研發(fā)

藥物外排泵是細(xì)菌耐藥性的重要研究靶點，對其抑制劑的發(fā)掘尤為重要。對于RND外排泵系統(tǒng)而言，甾體化合物conessine與抗生素競爭和MexAB-OprM的結(jié)合位點，抑制外排泵的功能，從而避免細(xì)胞內(nèi)抗生素流失，維持和恢復(fù)其抗菌活性[53]。PaβN及其衍生物能夠抑制銅綠假單胞菌RND外排泵的功能，提高細(xì)菌對氟喹諾酮類、β-內(nèi)酰胺類和大環(huán)內(nèi)酯類等藥物的敏感性[54]。抑制劑雖然能夠調(diào)控外排泵的活性，但是其臨床應(yīng)用會受到其毒性的限制。目前，外排泵抑制劑的主要研究方向在于植物活性分子，因其具有易于獲得以及對人體副作用小等特點。自然產(chǎn)生的利血平、胡椒堿、單萜、兒茶素、花青素和2-（4-丙氧苯基）喹啉衍生物等對金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌等菌株有良好抑制作用，甚至可以對其耐藥性產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)效果[55]。

4 結(jié)語

RND外排泵分布于許多致病菌株，是革蘭陰性菌產(chǎn)生多重耐藥性的主要原因之一。對于AcrAB-TolC、MexAB-OprM、MexXY-OprM等的研究表明，RND外排系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和作用機制主要有以下特點。①外膜蛋白、內(nèi)膜蛋白、周質(zhì)膜融合蛋白按一定比例形成跨越內(nèi)膜、膜間隙、外膜的蛋白復(fù)合體，從而在功能上發(fā)生關(guān)聯(lián)。②對于大腸埃希菌AcrAB-TolC系統(tǒng)而言，內(nèi)膜蛋白AcrB存在3種構(gòu)象（開放獲取狀態(tài)，藥物結(jié)合狀態(tài)和藥物排出狀態(tài)），與底物有不同的結(jié)合狀態(tài)，并通過構(gòu)象循環(huán)實現(xiàn)藥物運輸。其他RND外排泵的內(nèi)膜蛋白是否也存在與底物結(jié)合時發(fā)生構(gòu)象變化的情況，尚有待進(jìn)一步研究。

基于對RND外排泵的結(jié)構(gòu)和功能研究，為開發(fā)新型抗耐藥小分子藥物提供了思路。首先，可以通過影響RND外排泵結(jié)構(gòu)裝配過程以干擾其功能，如通過干預(yù)AcrA與肽聚糖或AcrB之間的相互作用而阻斷AcrAB-TolC的組裝。其次，可以通過阻斷RND外排泵的調(diào)控通路干擾其外排作用，如阻斷MexXY系統(tǒng)中的PA5471通路。深入研究RND外排泵的轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及與群體感應(yīng)系統(tǒng)的相互關(guān)系，也可以為新藥研發(fā)提供思路。另外，基于RND結(jié)構(gòu)、功能和調(diào)控的抑制劑，也是逆轉(zhuǎn)耐藥性和未來研究應(yīng)重點關(guān)注的問題。

參 考 文 獻(xiàn)

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收稿日期：2021-06-24

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（No. 31771032，No. 51911530153）；國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃資助（No. S202010497055）

作者簡介：杜靜怡，女，生于2000年，主要研究方向為細(xì)菌耐藥性研究，E-mail： studentDJY@163.com

*通訊作者，E-mail： h.xie@whut.edu.cn