郄麗萍?姜明星?葛鹍鵬?隨子華?趙鵬鵬?馬婕?張雪霞?吳達(dá)

摘要：目的 通過響應(yīng)面法，優(yōu)化替考拉寧發(fā)酵培養(yǎng)基，并對發(fā)酵工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，來提高其發(fā)酵產(chǎn)量。方法 以游動放線菌TC19-3p-103為試驗(yàn)菌株，采用單因素試驗(yàn)確定發(fā)酵培養(yǎng)基考察因素的參考范圍；利用最陡爬坡試驗(yàn)確定響應(yīng)面試驗(yàn)的中心區(qū)域；利用Box-Behnken響應(yīng)面法，確定了發(fā)酵培養(yǎng)基中的有機(jī)氮源最佳濃度組合；并對起始攪拌轉(zhuǎn)速與通氣量這兩個發(fā)酵工藝參數(shù)進(jìn)行單因素考察；在發(fā)酵過程中，采用流加技術(shù)控制碳源濃度。結(jié)果 經(jīng)優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基，其搖瓶產(chǎn)量提高了31.6%；50L罐發(fā)酵工藝參數(shù)優(yōu)化后，發(fā)酵水平達(dá)到8558 mg/L。 結(jié)論 優(yōu)化后的發(fā)酵工藝，顯著提高了替考拉寧的產(chǎn)量，為其工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：替考拉寧；響應(yīng)面法；發(fā)酵工藝；

中圖分類號：R978.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Response surface methodology to optimize the fermentation medium

of teicoplanin and its expanded culture

Qie Li-ping1， Jiang Ming-xing2， Ge Kun-peng1， Sui Zi-hua2， Zhao Peng-peng1， Ma Jie1， Zhang Xue-xia1， and Wu Da2

（1 National Engineering Research Center of Microbial Medicine， Hebei Industry Microbial Metabolic? ?Engineering & Technology Research Center， New Drug Research & Development Company of NCPC ， Shijiazhuang 050015;

2 Huasheng Company of NCPC， Shijiazhuang 050015）

Abstract Objective To optimize the fermentation medium of teicoplanin by response surface methodology and optimize the fermentation process parameters to increase its fermentation yield. Methods The Actinoplanes teichomyceticus TC19-3p-103 was used as the test strain. The single factor test was used to determine the reference range of the fermentation medium to investigate factors. The steepest climbing test was used to determine the central area of the response surface test. The Box-Behnken response surface method was used to determine the optimal concentration combination of organic nitrogen sources in the fermentation medium. The two fermentation process parameters， the initial stirring speed and aeration rate， were investigated by a single factor. The fed-batch technology was used to control the concentration of the carbon source in the fermentation process. Results The optimized fermentation medium increased the shake flask yield by 31.6%. After the optimization of the fermentation process parameters in the 50 L tank， the fermentation level reached 8，558 mg/L. Conclusion The optimized fermentation process has significantly increased the production of teicoplanin and laid the foundation for its industrial production.

Key word Teicoplanin; Response surface analysis; Fermentation process

替考拉寧是Parenti等在游動放線菌（Actinoplanes teichomyceticus）的發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)的發(fā)酵產(chǎn)物，是由結(jié)構(gòu)十分相近的5個主要組分（TA2-1，TA2-2，TA2-3，TA2-4，TA2-5），以及另外一個活性組分（TA3-1）組成，主要組分的差異僅在于?；鶄?cè)鏈的不同，都是替考拉寧的有效成分，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1。替考拉寧分子中的部分氨基酸以乙酸鹽和酪氨酸為生物合成前體，而5個主要組分所差異的酰基側(cè)鏈則分別以亞油酸、L-纈氨酸、油酸、異亮氨酸和亮氨酸為前體衍生而來[1-3]。

替考拉寧是繼萬古霉素、去甲基萬古霉素后發(fā)現(xiàn)的另一種抗耐藥菌的糖肽類抗生素[4]，替考拉寧通過與D-丙氨酰D-丙氨酸殘基特異性結(jié)合，阻斷細(xì)菌細(xì)胞壁中肽聚糖的合成，從而抑制和殺滅細(xì)菌。Boast等[5]指出，替考拉寧與萬古霉素的抗菌譜相似，但腎毒性風(fēng)險比較低，其導(dǎo)致紅人綜合征極為罕見，這些優(yōu)勢也促進(jìn)了其在兒科的應(yīng)用。

培養(yǎng)基優(yōu)化是提高產(chǎn)量的重要手段之一。王德森等[6]采用單因素和正交試驗(yàn)研究發(fā)酵培養(yǎng)基組成，探討了搖瓶發(fā)酵的主要影響因子，優(yōu)化后的發(fā)酵水平較原工藝提高40%；鄒昆等[7]通過響應(yīng)面CCD方法優(yōu)化替考拉寧發(fā)酵培養(yǎng)基，產(chǎn)量提高23.3%。本研究是針對本實(shí)驗(yàn)室誘變獲得的新高產(chǎn)突變菌進(jìn)行培養(yǎng)基及發(fā)酵工藝優(yōu)化，解決發(fā)酵培養(yǎng)基放大中存在的問題，提高發(fā)酵水平，降低生產(chǎn)成本，實(shí)現(xiàn)放大生產(chǎn)的目的。

1 材料與方法

1.1 菌株

菌株：游動放線菌（Actinoplanestei chomyceticus）TC19-3p-103 本實(shí)驗(yàn)室保存

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 斜面培養(yǎng)基（g/L）

可溶性淀粉10，K2HPO4 1， MgSO4·7H2O 1， NaCl 1，（NH4）2SO4 2，CaCO3 2 ，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001，MnCl2.7H2O 0.001，瓊脂16，pH 7.2。

1.2.2 種子培養(yǎng)基（g/L）

淀粉20，葡萄糖5，蛋白胨10，玉米漿5，KH2PO4 0.2，CaCO3 3，pH 7.2。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）

淀粉40，葡萄糖10，棉籽餅粉6，酵母粉10，玉米漿10，纈氨酸0.5，KH2PO4 0.2，CaCO3 3，pH 6.5。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 斜面培養(yǎng)

取0.1 mL經(jīng)過快速解凍的甘油管保藏的孢子懸液于中管斜面上，涂布均勻，28℃培養(yǎng)，8～10 d。

1.3.2 種子瓶培養(yǎng)

從中管斜面上挖取成熟培養(yǎng)物接入250 mL三角瓶中，裝料量40 mL；搖床轉(zhuǎn)速220 r/min，培養(yǎng)2 d。

1.3.3 發(fā)酵瓶培養(yǎng)

從種子瓶中吸取2～3 mL培養(yǎng)成熟的種子液接入250 mL三角瓶中，裝料量40 mL，搖床轉(zhuǎn)速220 r/min，培養(yǎng)7～8 d。

1.3.4 50 L罐發(fā)酵培養(yǎng)

50 L發(fā)酵罐（上海國強(qiáng)生化工程裝備有限公司）。采用二級發(fā)酵，中管斜面菌種挖塊半支，接種于種子培養(yǎng)基中（150 mL/1000 mL三角瓶），28℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。發(fā)酵罐裝料量為30 L，接種量為5%，培養(yǎng)溫度28℃，培養(yǎng)周期8 d。

1.4 分析方法

1.4.1 產(chǎn)物檢測采用HPLC分析方法

取5 mL發(fā)酵液，加入等體積的無水乙醇搖勻浸泡1 h，3000 r/min離心10 min，取上清，純化水稀釋至適當(dāng)濃度，進(jìn)行HPLC分析。

色譜條件：Kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）柱;流動相A為0.02 mol/L乙酸銨；流動相B為純乙腈；梯度洗脫：流動相A 0～9 min 82%→68%，9～9.5 min 68%～82%，9.5～15 min 82%；檢測波長254 nm；柱溫40℃；進(jìn)樣量10 μL，進(jìn)樣速度1 mL/min。

1.4.2 菌濃測定

取10 mL發(fā)酵液置于離心管中，3000 r/min離心10 min，計算固形物體積占發(fā)酵液的比例。

1.4.3 殘總糖測定

殘總糖測定采用斐林試劑法。

1.4.4 氨氮測定

氨氮測定采用甲醛法。

1.5 培養(yǎng)條件優(yōu)化方法

1.5.1 單因素試驗(yàn)優(yōu)化

單因子包括酵母粉、棉籽餅粉和玉米漿。采用單因素試驗(yàn)，考察各因素對發(fā)酵水平的影響，以確定各因素適合替考拉寧合成的參考范圍。

1.5.2 最陡爬坡法及Box-Behnken設(shè)計法優(yōu)化

在單因素的基礎(chǔ)上，對3種有機(jī)氮源采用最陡爬坡法進(jìn)行優(yōu)化；并應(yīng)用基于Box-Behnken設(shè)計的響應(yīng)曲面法進(jìn)行試驗(yàn)，以有效提高配方優(yōu)化的效率。BBD法優(yōu)點(diǎn)是應(yīng)用于因素數(shù)在3～7個內(nèi)的試驗(yàn)；試驗(yàn)次數(shù)為15～62次，在因素數(shù)相同時比中心復(fù)合設(shè)計所需的試驗(yàn)次數(shù)少。

1.5.3 50 L罐發(fā)酵工藝優(yōu)化方法

采用單因素法對攪拌轉(zhuǎn)速、通氣量進(jìn)行考察。對碳源采用流加的方法，控制其在亞適量范圍，提高發(fā)酵產(chǎn)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

2.1.1 單因素考察有機(jī)氮源含量對發(fā)酵的影響

對原基礎(chǔ)配方中3種氮源，酵母粉、棉籽餅粉、玉米漿進(jìn)行單因素?fù)u瓶實(shí)驗(yàn)，考查其對替考拉寧發(fā)酵的產(chǎn)量的影響。每個實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個平行，取平均值。結(jié)果見圖2。

由圖2可知，原基礎(chǔ)配方中逐步增加酵母粉含量，替考拉寧發(fā)酵水平提高最顯著；3種氮源對發(fā)酵影響顯著性的順序?yàn)椋航湍阜?棉籽餅粉>玉米漿。酵母粉組菌絲量達(dá)到35%；棉籽餅粉組菌絲量達(dá)到28%；玉米漿組菌絲量達(dá)到26%。搖瓶放瓶菌絲量也是酵母粉組最高。

2.1.2 最陡爬坡試驗(yàn)確定各因子的濃度范圍

響應(yīng)面擬合方程只有在考察的臨近區(qū)域里才能充分近似真實(shí)情況，通過爬坡試驗(yàn)來實(shí)現(xiàn)逼近具有最大值的響應(yīng)區(qū)域。根據(jù)“2.1.1”單因素考察的結(jié)果，確定酵母粉、棉籽餅粉和玉米漿3個因素取值范圍和變化步長，做最陡爬坡實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見表1。酵母粉逐漸增大，棉籽餅粉和玉米漿逐漸減少，替考拉寧的產(chǎn)量沿著1到3的路徑增加，第3組到達(dá)最高點(diǎn)7509 mg/L，然后沿著4至5的路徑下降，即較好水平在試驗(yàn)3附近。因此，以第3組各因素水平為中心值作為BBD的中心點(diǎn)進(jìn)行RSM試驗(yàn)設(shè)計。

2.1.3 響應(yīng)面Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計

根據(jù)單因素和最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果，采用響應(yīng)面BBD對顯著影響產(chǎn)量的3個有機(jī)氮源因素（酵母粉，棉籽餅粉，玉米漿）的最佳水平及相互作用進(jìn)行考察，X1、X2、X3為酵母粉、棉籽餅粉、玉米漿的編碼。表2～3為BBD實(shí)驗(yàn)設(shè)計及其結(jié)果。

經(jīng)Design-Expert12軟件擬合，各因素對替考拉寧產(chǎn)量的編碼值回歸方程如下：

替考拉寧產(chǎn)量=7730+345.75X1+259.25 X2+173.00X3-209.00 X1X2+78X1X3+73.50X2X3-337.75X12-502.75X22-396.75X32?；貧w方程的校正系數(shù)R2為0.9539，說明方程的擬合度良好，可有效預(yù)測替考拉寧產(chǎn)量的最優(yōu)組合。

方差分析表見表4，一次項(xiàng)，二次項(xiàng)的P值<0.05，說明該模型顯著；失擬項(xiàng)P值為0.0948，說明模型失擬項(xiàng)不顯著，殘差是隨機(jī)誤差所引起。

2.1.4 響應(yīng)面交互作用分析

利用Origin2018軟件繪制響應(yīng)面曲線，通過分析相關(guān)變量之間的交互作用，從而確定最優(yōu)解。酵母粉、棉籽餅粉、玉米漿的三維響應(yīng)面及對應(yīng)等高線如圖3所示。X1X2、X1X3和X2X3的交互作用的響應(yīng)面都是開口向下的凸面，說明試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)響應(yīng)值存在最優(yōu)解。交叉項(xiàng)X1X2等高線呈橢圓形，則說明它們的交互作用對響應(yīng)值影響顯著[8]。交叉項(xiàng)X2X3，X1X3等高線接近圓形，說明其交互作用不明顯，這與表4中P>0.05結(jié)果一致。

2.1.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

通過進(jìn)一步搖瓶實(shí)驗(yàn)對軟件預(yù)測最優(yōu)解進(jìn)行驗(yàn)證。根據(jù)模擬方程，軟件預(yù)測給出的最優(yōu)解為7844 mg/L。各因素的取值分別為：酵母粉22.833 g/L、棉籽餅粉10.257 g/L、玉米漿10.601 g/L，發(fā)酵其他條件不變，共進(jìn)行3批搖瓶試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果分別為7792、7880和7613 mg/L，均值為7761 mg/L。誤差在1.0%，說明模型可靠，證明用單因素、最陡爬坡、響應(yīng)面法優(yōu)化替考拉寧的培養(yǎng)基方法可行。對比優(yōu)化前后的發(fā)酵水平，提高幅度為31.6%。

2.2 發(fā)酵罐工藝優(yōu)化

2.2.1 攪拌轉(zhuǎn)速、通氣量對發(fā)酵工藝的影響

采用單因素對起始攪拌轉(zhuǎn)速、通氣量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)考查。本實(shí)驗(yàn)分別設(shè)置100、150、200和300 r/min作為初始轉(zhuǎn)速，發(fā)酵中后期采用控制溶氧達(dá)到30%～60%，控制轉(zhuǎn)速；分別設(shè)置30、33、36和39 L/min通氣量進(jìn)行單因素試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4～5。

從圖4可以看出，發(fā)酵起始攪拌轉(zhuǎn)速對替考拉寧發(fā)酵產(chǎn)量影響顯著，隨著起始攪拌轉(zhuǎn)速的降低，發(fā)酵單位顯著提高。在初始轉(zhuǎn)速300 r/min時90 h罐上起沫嚴(yán)重。鏡檢菌絲狀態(tài)發(fā)現(xiàn)，在高轉(zhuǎn)速情況下發(fā)酵罐里菌絲狀態(tài)是分散的菌絲，與搖瓶里的結(jié)微球狀態(tài)不同。在100和150 r/min時菌絲生長為微球，與搖瓶狀態(tài)一致。本實(shí)驗(yàn)表明替考拉寧產(chǎn)生菌在生長初期對攪拌的剪切力敏感，低攪拌轉(zhuǎn)速可以減少剪切力對菌絲生長的影響，菌絲可以生長為微球狀態(tài)。發(fā)酵中期因溶氧的需求提高攪拌轉(zhuǎn)速，菌絲球受剪切力的影響變小，仍能保持自身狀態(tài)。

由圖5可以看出通氣量對替考拉寧發(fā)酵產(chǎn)量同樣影響顯著，通氣量30 L/min時效果最差，通氣量36 L/min時，替考拉寧產(chǎn)量達(dá)到最高7284 mg/L，可作為優(yōu)選條件。通氣量也是改善發(fā)酵罐內(nèi)溶氧的有效手段，其對菌絲狀態(tài)影響小。攪拌和通氣兩者相輔相成為發(fā)酵過程提供一個適宜的溶氧環(huán)境。

2.2.2 碳源流加對發(fā)酵產(chǎn)量的影響

對發(fā)酵組分中的碳源采取流加技術(shù)，當(dāng)還原糖的濃度低于12 g/L時，間歇性補(bǔ)入30%葡萄糖，控制還原糖的濃度在5～10 g/L。由圖6可以看出，隨著菌體生長到對數(shù)期后期，替考拉寧開始產(chǎn)生。菌絲生長進(jìn)入平臺初期，溶氧到達(dá)底部，替考拉寧已經(jīng)開始大量合成。流加碳源，維持菌體生長的平臺期，也就是維持替考拉寧的高效合成期，達(dá)到高產(chǎn)的目的。50 L發(fā)酵罐182 h放罐時替考拉寧產(chǎn)量達(dá)到8558 mg/L，進(jìn)一步提高了17.5%。

發(fā)酵過程營養(yǎng)成分的濃度，對發(fā)酵進(jìn)入次級代謝有顯著地影響。營養(yǎng)成分濃度過高不僅對菌體的生長有一定抑制作用[9]，還會延遲發(fā)酵進(jìn)入次級代謝的進(jìn)程。采用流加技術(shù)控制營養(yǎng)成分在亞適量范圍，更有效地提高了后期菌體活力不足和產(chǎn)能下降的問題[10-14]。

3 結(jié)論

本研究基于搖瓶工藝的發(fā)酵培養(yǎng)基，對新菌種發(fā)酵放大進(jìn)行研究。新菌種用原發(fā)酵培養(yǎng)基在發(fā)酵罐放大培養(yǎng)中表現(xiàn)為發(fā)酵中后期菌絲量下降、產(chǎn)抗能力后勁不足?？紤]可能是原培養(yǎng)基氮源不足造成的發(fā)酵后期營養(yǎng)不足，造成菌體生長受限，菌體活性降低；同時菌球裂解，菌濃降低；從而嚴(yán)重影響到產(chǎn)物合成能力。經(jīng)用單因素、最陡爬坡、響應(yīng)面法對發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，新培養(yǎng)基搖瓶產(chǎn)量提高了31.6%。由圖6可以看出，新培養(yǎng)基在50 L罐上發(fā)酵中后期維持了適度的菌體濃度，分泌期延長，新菌種在生命的后期最大限度的合成和分泌次級代謝產(chǎn)物。

在發(fā)酵培養(yǎng)的不同時期，微生物對溶氧要求是不同的。往往在發(fā)酵中期，微生物處于旺盛生長時間，對氧的需要量較高；而在發(fā)酵初期和發(fā)酵后期微生物的需氧量較低。在發(fā)酵罐工藝優(yōu)化中，發(fā)現(xiàn)替考拉寧產(chǎn)生菌對發(fā)酵罐剪切力敏感，降低初始攪拌轉(zhuǎn)速對菌絲初期生長階段的結(jié)球有利，同時對發(fā)酵產(chǎn)能有利。這與金志華[15]報道替考拉寧產(chǎn)生菌Actinoplanes teichomyceticus對剪切力較敏感一致通過對初始攪拌轉(zhuǎn)速及通氣量的優(yōu)化，50 L罐發(fā)酵水平達(dá)到7284 mg/L。

采用流加技術(shù)控制碳源含量在亞適量范圍，更有效地提高菌體的生物量和產(chǎn)量，50 L發(fā)酵罐的發(fā)酵水平達(dá)到了8558 mg/L，又提高了17.5%，取得良好的效果。50 L罐工藝開發(fā)的成功為替考拉寧進(jìn)一步放大生產(chǎn)奠定了堅實(shí)的基礎(chǔ)。

參 考 文 獻(xiàn)

Malabarba A， Strazzolini P， Depaoli A， et al. Teicoplanin， antibiotics from Actinoplanes teichomyceticus nov. sp. Ⅵ. chemical degradation： Physicochemical and biological properties of acid hydrolysis products[J]. J Antibiot， 1984， 37（9）： 988-999.

Ackermann B L， Regg B T， Colombo L， et al. Rapid analysis of antibiotic-containing mixtures from fermentation broths by using liquid chromatography-electrospray ionizationmass spectrometry anmatrixassisted laser desorption ionization time of fligh massspectrometry[J]. J Am Soc Mass Spectr， 1996， 7： 1227-1237.

Jin Z， Wang M， Cen P. Production of teicoplanin by valin analogue-resisitant mutant strain of Actionplanes teichomyceticus[J]. Appl Microbiol Biot， 2002， 58（1）： 63-66.

吳亞銘. 新一代抗生素——替考拉寧[J]. 中國抗生素雜志， 1999， 24（增刊）： 51.

Boast A， Gwee A， Gwee A. Teicoplanin should we be doing routine therapeutic drug monitoring in children[J]. Pediatr Infect Dis J， 2017， 36（ 11）： 1110.

王德森， 張祝蘭， 唐文力， 等. 替考拉寧產(chǎn)生菌A .teichomycoticus FIM-37 發(fā)酵條件優(yōu)化[J]. 藥物生物技術(shù)， 2017， 24（4）： 310-314.

鄒昆， 張奇， 夏永登. 響應(yīng)面法優(yōu)化替考拉寧發(fā)酵培養(yǎng)基的研究[J]. 中國抗生素雜志， 2011， 36（9）： 671-675.

Bhattacharjee K， Joshi S R. A selective medium for recovery and enumeration of endolithic bacteria[J]. J Microbiol Meth， 2016， 129： 44-54．

熊宗貴.發(fā)酵工藝原理[M]. 北京： 中國醫(yī)藥科技出版， 2003： 148-149.

徐瑤， 吳濤， 郭美錦， 等. 氮源對阿維菌素合成的影響及基于二氧化碳釋放速率的阿維菌素發(fā)酵調(diào)控[J]. 生物工程學(xué)報， 2020， 36（2）： 287-294.

陳凝， 王永紅， 儲炬， 等. 培養(yǎng)基成分和補(bǔ)料對阿維菌素發(fā)酵過程中除蟲鏈霉菌菌絲形態(tài)的影響[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報， 2007， 26（4）： 496-501.

李瑜， 李一萌， 楊麗， 等. 5 L發(fā)酵罐高密度培養(yǎng)番茄紅素工程菌及其發(fā)酵調(diào)價優(yōu)化[J]. 現(xiàn)代食品科技， 2020， 36（6）： 137-146.

劉景陽， 劉云鵬， 徐慶陽. 谷氨酸全營養(yǎng)流加發(fā)酵新工藝[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)， 2021， 47（7）： 14-20.

吳江， 洪文榮， 蘇敏， 等. 釀酒酵母XM2-9流加發(fā)酵生產(chǎn)甲基硒代半胱氨酸[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報， 2021， 40（7）： 103-111.

金志華. 抗生素發(fā)酵的若干微生物及工程問題研究[D]. 杭州： 浙江大學(xué)， 2001.

收稿日期：2021-06-25

基金項(xiàng)目：河北省科技研發(fā)平臺建設(shè)專項(xiàng)（No. 199676154H）

作者簡介：郄麗萍，女，生于1974年，高級工程師，從事生物制藥研究， E-mail： qieliping1993@163.com

*通訊作者，E-mail： wu-da@126.com