王以鑫 彭珍華 胡建林 賓 婕 譚建林*

1.昆明醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500；2.云南省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院/國(guó)家熱帶農(nóng)副產(chǎn)品監(jiān)督檢驗(yàn)中心，云南 昆明 650223；3.紅河衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，云南 蒙自 661199

香茅草為禾本科香茅屬植物香茅Cymbopogoncitratus(DC.) Stapf的全草[1]，盛產(chǎn)于我國(guó)廣東、福建、廣西、云南等[2]。目前，對(duì)香茅草的化學(xué)成分研究多集中于其揮發(fā)性成分，諸多報(bào)道表明香茅草揮發(fā)性物質(zhì)具有鎮(zhèn)靜、抗焦慮[3]、抗痙攣、抗菌殺菌[4-5]、抗氧化[6-7]及助消化等藥用價(jià)值，廣泛用于食品工業(yè)[8-10]、日用化學(xué)和醫(yī)藥工業(yè)[11-12]。有研究[13]表明，香茅草精油的揮發(fā)性物質(zhì)中含量最高的是D-香茅醛(35.69%)，香葉醇(16.56%)及香茅醇(12.66%)。因此香茅草中香茅醛、香茅醇及香葉醇的含量是評(píng)價(jià)香茅草功能性優(yōu)劣的重要指標(biāo)之一。香茅草作為藥食同源植物，其精油因天然安全性高、抑菌抗氧化特性優(yōu)良、環(huán)境可降解等環(huán)保屬性，高度契合于我國(guó)居民對(duì)健康養(yǎng)生的傳統(tǒng)理念與國(guó)家對(duì)經(jīng)濟(jì)優(yōu)質(zhì)發(fā)展的新形勢(shì)發(fā)展要求，具有廣闊的應(yīng)用前景[14]。隨著其應(yīng)用領(lǐng)域的不斷擴(kuò)寬，制訂香茅草的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)迫在眉睫。由于水分過(guò)多會(huì)導(dǎo)致霉變，引入安全性問(wèn)題，且影響食藥價(jià)值，有效成分的含量多少也直接影響療效。且有專家提出：重金屬、農(nóng)藥殘留量檢查是中藥材走向世界，創(chuàng)立綠色中藥名牌產(chǎn)品的中藥標(biāo)志之一[15]。為了綜合開(kāi)發(fā)香茅草產(chǎn)品及保障用藥安全，有必要從不同角度研究香茅草內(nèi)在質(zhì)量，對(duì)不同來(lái)源香茅草藥材的質(zhì)量進(jìn)行全面評(píng)價(jià)。本實(shí)驗(yàn)建立了同時(shí)測(cè)定香茅草中香茅醛、香茅醇及香葉醇3種成分的GC-MS方法，對(duì)不同來(lái)源香茅草的3種揮發(fā)性成分、水分，總灰分、酸不溶性灰分、重金屬、砷鹽和農(nóng)藥殘留進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)以上研究，更加全面地評(píng)價(jià)各地香茅草的質(zhì)量，香茅草藥材的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 氣質(zhì)聯(lián)用儀(日本島津GCMS-QP2010)；SA710型原子熒光光譜儀(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；AA800型石墨爐原子吸收光譜儀(美國(guó)PE公司)；MARS-X型微波消解儀(美國(guó)CEM公司)； Milli-Q型超純水機(jī)(美國(guó)Millipore公司)；超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司)；0.1 mg分析天平(瑞士梅特勒公司)；Research?plus 20～200 μL和10～1000 μL移液槍(德國(guó) Eppendorf 公司 )。

1.2 試藥 對(duì)照品：香茅醛對(duì)照品(批號(hào)：AL200504-18，純度≥97.1%)、香茅醇對(duì)照品(批號(hào)：3522011，純度≥96.0%)、香葉醇對(duì)照品(批號(hào)：2091805，純度≥99.3%)購(gòu)自壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司；砷、汞、鉛、鎘元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(1000μg/mL，國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心)；硝酸(AR級(jí)，四川西隴科學(xué)有限公司)，過(guò)氧化氫(AR級(jí)，四川西隴科學(xué)有限公司)，甲醇(AR，重慶川東化工有限公司)；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q去離子水。香茅草樣品的產(chǎn)地具體情況見(jiàn)表1。

表1 香茅草樣品來(lái)源

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測(cè)定

2.1.1 GC-MS條件 氣相色譜條件：采用日本島津GCMS-QP2010氣質(zhì)聯(lián)用儀；色譜柱：RTX-MAX(30 m×0.25 mm× 0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；載氣：高純氦氣(99.999%)；柱流速：3 mL/min；分流比10∶1；程序升溫：40 ℃，保持2 min，3 ℃/min升到240 ℃，保持20 min。

質(zhì)譜條件：離子源溫度230 ℃；接口溫度：250 ℃；檢測(cè)器電壓：1.35kv；采集方式：SIM；定量離子(m/z)：香茅醛(41.0)、香茅醇(69.0)、香葉醇(69.0)；混合對(duì)照品溶液及香茅草樣品溶液的GC-MS色譜圖(SIM)如圖1所示。

2.1.2 對(duì)照品溶液的配制 分別準(zhǔn)確稱取21.53 mg香茅醛、14.89 mg香茅醇和21.27 mg香葉醇標(biāo)準(zhǔn)品置10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成2153、1489、2127 μg/mL對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別準(zhǔn)確移取1.0 mL香茅醛、香茅醇和香葉醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液置10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成混合對(duì)照品溶液(香茅醛：215.3 μg/mL；香茅醇：148.9 μg/mL和香葉醇：212.7 μg/mL)。

2.1.3 樣品前處理 取香茅草粉末約5.0 g，精密稱定， 置離心管中，加入25 mL甲醇，在常溫下超聲(59KHz)提取1 h，離心，取上清液濾過(guò)，即得。

2.1.4 方法學(xué)研究

2.1.4.1 線性關(guān)系考察 精密吸取混合對(duì)照品溶液適量，以甲醇稀釋制成 6 個(gè)系列濃度的混合對(duì)照品溶液，按優(yōu)化的GC-MS條件進(jìn)樣測(cè)定，以各對(duì)照品峰面積積分值對(duì)其相應(yīng)的濃度進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見(jiàn)表2。 香茅醛、香茅醇和香葉醇在一定的濃度范圍內(nèi)與峰面積的線性關(guān)系良好。

表2 香茅草中香茅醛、香茅醇和香葉醇的線性關(guān)系考察結(jié)果

2.1.4.2 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液適量，按優(yōu)化的GC-MS條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積，計(jì)算香茅醛、香茅醇和香葉醇的RSD分別為2.31%、3.46%、1.48%，表明儀器精密度良好。

2.1.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批香茅草供試品(S5)適量，按“3” 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液， 按優(yōu)化的GC-MS條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算得到香茅醛、香茅醇和香葉醇的RSD 分別為5.02%、5.69%、3.65%，標(biāo)明該方法重復(fù)性良好。

2.1.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取香茅草供試品溶液(S5)，分別在制備后0、2、4、8、12、24 h，按優(yōu)化的GC-MS條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算得到香茅醛、香茅醇和香葉醇的RSD 分別為2.61%、1.76%、1.49%，標(biāo)明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.4.5 加標(biāo)回收率試驗(yàn) 取已知成分含量的同一批香茅草供試品(S5)6份，每份約5.0g，分別精密加入一定量的各對(duì)照品，按樣品前處理方法制備供試品溶液，按優(yōu)化的GC-MS條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算平均加標(biāo)回收率及RSD，得到香茅醛、香茅醇和香葉醇的平均加標(biāo)回收率分別為98.9%(RSD=2.59%)、96.32%(RSD=3.64%)和95.8%(RSD=2.31%)。

2.1.5 樣品含量測(cè)定 取14批次香茅草樣品適量，按“3”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按優(yōu)化的GC-MS條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算樣品中香茅醛、香茅醇、香葉醇的含量。結(jié)果見(jiàn)表3。

2.2 水分的測(cè)定 按照《中國(guó)藥典》(2020年版)中水分測(cè)定法(四部通則0832)第二法[16]，根據(jù)減失的重量，計(jì)算香茅草樣品含水量(%)。結(jié)果見(jiàn)表3。

2.3 總灰分測(cè)定 按照《中國(guó)藥典》(2020年版)中灰分測(cè)定法[16](四部通則2302)測(cè)定總灰分，根據(jù)殘?jiān)亓?，?jì)算香茅草樣品總灰分的含量(%)。結(jié)果見(jiàn)表3。

2.4 酸不溶性灰分測(cè)定 按照《中國(guó)藥典》(2020年版)中灰分測(cè)定法[16](四部通則2302)測(cè)定酸不溶性灰分，根據(jù)殘?jiān)亓?，?jì)算香茅草樣品中酸不溶性灰分的含量(%)。結(jié)果見(jiàn)表3。

2.5 重金屬、砷鹽殘留 按照食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中總汞及有機(jī)汞的測(cè)定第一法[17]檢查總汞；食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中總砷及無(wú)機(jī)砷的測(cè)定第二法[18]檢查總砷；食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中鉛的測(cè)定第一法[19]檢查鉛；食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中鎘的測(cè)定[20]檢查鎘。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同產(chǎn)地香茅草中香茅醛、香茅醇、香葉醇、水分、總灰分、酸不溶性灰分、重金屬、砷鹽測(cè)定 (n=3)

續(xù)表3 表3 不同產(chǎn)地香茅草中香茅醛、香茅醇、香葉醇、水分、總灰分、酸不溶性灰分、重金屬、砷鹽測(cè)定 (n=3)

2.6 農(nóng)藥殘留 色譜條件：采用Penomenex Kinetex 1.7μ XB-C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；柱溫40 ℃；樣品溫度10 ℃；流動(dòng)相A：0.1%甲酸+5 mmol/L乙酸銨溶液(準(zhǔn)確稱取0.3850 g乙酸銨，移取1 mL甲酸加入到1 L水中，即得)，流動(dòng)相B：乙腈；進(jìn)樣量2 μL；流速0.4 mL/min。梯度洗脫(0～2.5 min，35%B→95%B；2.5～3.8 min，保持95 %B；3.8～3.9 min，95 %B→35 %B；3.9～6.0 min，保持35 %B)。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；脫溶劑溫度500 ℃；氮?dú)饬魉?000 L/h；離子源溫度200 ℃；錐孔氣流量55L/h；毛細(xì)管電壓3.5 kV；碰撞氣為氬氣。

采用優(yōu)化的方法對(duì)不同來(lái)源的14批次香茅草樣品進(jìn)行33種農(nóng)藥殘留檢測(cè)，33種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液UPLC-MSMS色譜圖如圖2所示。其中3批樣品檢出農(nóng)藥殘留，其中1批樣品檢出咪鮮胺(3.12 mg/kg)、多菌靈(0.0518 mg/kg)、吡蟲(chóng)啉(0.0351 mg/kg)、烯酰嗎啉(17.6 mg/kg)和甲基硫菌靈(0.0471 mg/kg)；另外2批樣品檢出多菌靈(0.0157 mg/kg和0.0129 mg/kg)，其余樣品均未檢出農(nóng)藥殘留。

3 討論

3.1 提取工藝的選擇 試驗(yàn)前期分別考察了水蒸氣蒸餾法、乙醚索氏提取法、甲醇超聲提取法及乙酸乙酯超聲提取法對(duì)樣品提取效果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用甲醇超聲提取的效果最好，因此本實(shí)驗(yàn)選用操作方便的超聲提取方式。同時(shí)對(duì)比了不同的提取時(shí)間(30 min、60 min、1 h)，最終選擇提取1 h。

3.2 不同來(lái)源地香茅草中香茅醛、香茅醇、香葉醇含量有一定差異 說(shuō)明香茅草的品種、生長(zhǎng)的環(huán)境、氣候、土壤特性等生態(tài)因子及產(chǎn)地加工方式對(duì)藥材質(zhì)量影響很大。

4 結(jié)論

水分控制對(duì)藥材商品質(zhì)量十分重要，若水分含量高于其藥材的安全水分含量，則藥材在貯藏過(guò)程中易腐爛變質(zhì)，影響藥材質(zhì)量。根據(jù)測(cè)定情況和一般養(yǎng)護(hù)經(jīng)驗(yàn)，規(guī)定本品水分不得過(guò)10.74%。

為了控制香茅草藥材的純度，所以對(duì)總灰分和酸不溶灰分進(jìn)行了測(cè)定，按照測(cè)定結(jié)果適當(dāng)下浮來(lái)設(shè)定指標(biāo)限度比較符合實(shí)際情況，規(guī)定本品總灰分不得多于7.72%，酸不溶性灰分不得多于1.26%。

按照國(guó)際市場(chǎng)對(duì)無(wú)公害綠色藥材的要求，對(duì)不同產(chǎn)地的香茅草進(jìn)行了重金屬、砷鹽及農(nóng)藥殘留檢測(cè)，結(jié)果表明，香茅草樣品符合《藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》[21](中華人民共和國(guó)對(duì)外貿(mào)易經(jīng)濟(jì)合作部)規(guī)定，及中國(guó)藥品生物制品檢定所《中藥中鉛、鎘、鉻、砷、汞測(cè)定方法起草說(shuō)明》[22]中提出的限量標(biāo)準(zhǔn)，即汞不高于0.2 ppm，砷不高于2 ppm，鉛不高于5 ppm，鎘不高于0.5 ppm。

本文對(duì)不同來(lái)源香茅草的香茅醛、香茅醇、香葉醇、水分、總灰分、酸不溶性灰分、重金屬、農(nóng)藥殘留進(jìn)行測(cè)定，為科學(xué)評(píng)價(jià)香茅草內(nèi)在質(zhì)量積累了科學(xué)資料，提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。