陳 丹 戚建中 符國成 陳海剛 楊一棟 李 柯

1.湘潭醫(yī)衛(wèi)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 湘潭 411102；2.華潤三九(郴州)制藥有限公司，湖南 郴州 423000；3.湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南 長沙 410013

復(fù)方板藍(lán)根顆粒由板藍(lán)根600 g、大青葉900 g組成，具有清熱解毒、涼血的功效，臨床用于溫病發(fā)熱、出斑、風(fēng)熱感冒、咽喉腫爛、流行性乙型腦炎、肝炎、腮腺炎，使用廣泛，療效明確。經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理局網(wǎng)站查證，全國共有150家生產(chǎn)企業(yè)。復(fù)方板藍(lán)根顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第十二冊(標(biāo)準(zhǔn)號：WS3-B-2377-97[1])。依據(jù)2011年《已上市中藥變更研究技術(shù)指導(dǎo)原則(一)》、2017年《已上市中藥生產(chǎn)工藝變更研究技術(shù)指導(dǎo)原則》、2019年《已上市中藥藥學(xué)變更研究技術(shù)指導(dǎo)原則》(征求意見稿)等技術(shù)指導(dǎo)原則，本品變更了藥品處方中已有藥用要求的輔料，改變了影響藥品質(zhì)量的生產(chǎn)工藝，為更系統(tǒng)、全面地評價工藝變更后產(chǎn)品的質(zhì)量，研究建立了本品指紋圖譜檢測方法[2-3]，采用2012年版中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)對10批成品進(jìn)行相似度評價，所建立的方法穩(wěn)定、可靠、重復(fù)性好，能夠更好地控制復(fù)方板藍(lán)根顆粒的質(zhì)量。

1 材料

1.1 儀器 Waters e2695高效液相色譜儀(美國沃特世公司)；梅特勒-托利多XS204電子分析天平(梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司)；KQ5200DA 型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥 鳥苷對照品(111977-201501，含量93.6%)，尿苷對照品(110887-201803，含量99.5%)，腺苷對照品(110879-200202，含量100%)，R,S-告依春對照品(111753-201706，含量100%)均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇[賽默飛世爾科技(中國)有限公司，色譜級]；其他試劑均為分析級。

1.3 樣品 復(fù)方板藍(lán)根顆粒[批號：1908001、1908002、1908003、1908004、1908005、1908006、1908007、1908008、1908009、19080010，華潤三九(郴州)制藥有限公司]。

2 方法與結(jié)果[4-8]

2.1 色譜條件 Kromasil 100-5-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以甲醇為流動相A，水為流動相B，梯度洗脫(0～2 min，3%A；2～20 min，3%→6% A；20～25 min，6%→9% A；25～33 min，9% A；33～40 min，9%→20% A；40～50 min，20% A；50～85 min，20%→60% A；85～90 min，60%→3% A；90～95 min，3% A)；檢測波長為254 nm，流速為0.8 mL·min-1；柱溫為25 ℃，進(jìn)樣體積10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 取尿苷對照品、鳥苷對照品、(R，S) -告依春對照品和腺苷對照品適量，精密稱定，加50%甲醇分別制成每1mL 含尿苷20 μg、鳥苷20 μg、(R，S)-告依春20 μg和腺苷25 μg 的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取本品約1.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加5%甲醇10 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理( 功率500 W，頻率40 kHz) 5 min使溶解，放冷，再稱定質(zhì)量，用水補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 精密吸取“2.2.1”項下對照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，按照“2.1”色譜條件操作，記錄色譜圖。如圖1所示。

2.3.2 精密度考察 取復(fù)方板藍(lán)根顆粒(批號1908001)，按確定的方法制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，指紋圖譜方法的精密度結(jié)果相似度>0.9，色譜峰相對保留時間及相對峰面積RSD<3%。結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性考察 取復(fù)方板藍(lán)根顆粒(批號1908001)，按確定的方法平行制備6份供試品溶液，測定指紋圖譜，指紋圖譜的重復(fù)性結(jié)果相似度>0.9，色譜峰相對保留時間及相對峰面積RSD<3%。結(jié)果表明：方法重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性考察 取復(fù)方板藍(lán)根顆粒(批號1908001)，按確定的方法制備供試品溶液，分別在約0、3、6、9、12、21、27、30、38、46、50、56 h進(jìn)樣，指紋圖譜方法的精密度結(jié)果相似度>0.9，色譜峰相對保留時間及相對峰面積RSD<3%。結(jié)果表明：供試品溶液在56h內(nèi)測定穩(wěn)定。

2.4 HPLC指紋圖譜的建立與共有峰的標(biāo)定

2.4.1 指紋圖譜的建立 取各批復(fù)方板藍(lán)根顆粒，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”色譜條件測定，進(jìn)樣10 μL，得到10批復(fù)方板藍(lán)根顆粒HPLC指紋圖譜，基于直觀法和指紋特征圖譜選擇要求(若峰數(shù)多于10個，且最大峰面積超過總峰面積的70%，或峰數(shù)多于20個，且最大峰面積超過總峰面積的60%，應(yīng)考慮去除該色譜峰)，擬定本品指紋圖譜特征峰個數(shù)為10個。并以分離效果好且具代表性的尿苷、鳥苷、(R,S)-告依春、腺苷作為參照峰。如圖2、圖3所示。

2.4.2 共有指紋峰的標(biāo)定 復(fù)方板藍(lán)根顆粒HPLC指紋圖譜中，共有色譜峰10個，以4號峰(R，S) -告依春為參照峰(S)，計算各色譜峰保留時間和保留峰面積與同一圖譜中S峰的保留時間和保留峰面積比值。見表1、表2。

表1 10批復(fù)方板藍(lán)根顆粒指紋圖譜共有峰的相對保留時間

表2 10批復(fù)方板藍(lán)根顆粒指紋圖譜共有峰的相對峰面積

2.5 相似度評價 取復(fù)方板藍(lán)根顆粒樣品，共計10批，按照擬定供試品溶液制備方法制備，色譜條件測定，記錄色譜圖，色譜圖扣除0～3.0 min(溶劑峰)，采用2012年版中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)，以R色譜圖為參照圖譜，時間窗寬度設(shè)定0.1 min，用平均數(shù)法生成各自對照指紋圖譜圖，同時計算相似度。色譜峰見圖4，計算結(jié)果見表3，結(jié)果表明：大生產(chǎn)樣品相似度均在0.95以上，說明按現(xiàn)有工藝能試制，批間差異小，樣品質(zhì)量穩(wěn)定。

3 討論

3.1 參照峰的選擇 參照文獻(xiàn)[9]分別收集處方中各藥味對應(yīng)的指標(biāo)成分對照品，配制相應(yīng)的對照品溶液，照指紋圖譜檢測方法檢測，在UV圖譜中無靛藍(lán)和靛玉紅的對應(yīng)的色譜峰，且該兩成分的色譜峰疊加在一起。氨基酸類成分(精氨酸、L-脯氨酸、亮氨酸)無紫外吸收，而尿苷、鳥苷、腺苷、(R，S)-告依春均能良好的分離，且保留時間及峰面積大小適中，前后無干擾峰，因此確定尿苷、鳥苷、腺苷、(R，S)-告依春作為指紋圖譜參照物。

3.2 不同品牌色譜柱考察 分別考察Waters-Xselect-C18、Kromasil 100-5-C18和Agilent ZOR BAX-C18三種色譜柱對指紋圖譜的影響。該色譜條件下，Agilent ZOR BAX-C18色譜柱供試品中各色譜峰成分分離效果明顯較差，Waters-Xselect-C18、Kromasil 100-5-C18均能較好的分離各個色譜峰，但Waters-Xselect-C18總峰數(shù)少于Kromasil 100-5-C18，故本試驗采用Kromasil 100-5-C18色譜柱，同時建議后續(xù)實驗使用同款色譜柱。

3.3 柱溫的考察 按擬定的方法對不同柱溫(20 ℃、25 ℃、30 ℃)進(jìn)行考察，結(jié)果柱溫的變化會對四個成分的保留時間造成影響，25 ℃時指紋圖譜整體分離效果最好，因此明確本方法柱溫為25 ℃。

3.4 不同流速的考察 按照初步確定的色譜條件，微調(diào)流速，考察不同流速(0.6 mL/min、0.8 mL/min、1.0 mL/min)。結(jié)果不同流速對色譜峰的保留時間有所影響，流速0.8 mL/min指紋圖譜整體分離效果最好，因此流速定為0.8 mL/min。

4 結(jié)論

本研究建立了復(fù)方板藍(lán)根顆粒的HPLC指紋圖譜方法，方法學(xué)考察，色譜峰相對保留時間及相對峰面積RSD均小于3%。采用建立的指紋圖譜檢測方法對10批復(fù)方板藍(lán)根顆粒進(jìn)行測定，大生產(chǎn)樣品相似度均在0.95以上，表明采用指紋圖譜對樣品質(zhì)量進(jìn)行控制，方法簡便、穩(wěn)定、專屬性強、重復(fù)性好，能輔助含量測定方法全方位地保證藥品質(zhì)量的穩(wěn)定均一，對復(fù)方板藍(lán)根顆粒臨床安全合理用藥具有重要意義。