盧曉微 周智鵬 張輝陽(yáng) 曾陽(yáng)東 成 戈 蔣 宇 蘇夢(mèng)瑤

(桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院放射科，廣西桂林市 541001，電子郵箱：lxwsally@163.com)

近年來(lái)，我國(guó)腦血管疾病的發(fā)病率逐漸上升，其中以缺血性腦血管病多見(jiàn)，缺血性腦血管病具有發(fā)病率高、病死率高的特點(diǎn)，嚴(yán)重危害人類健康[1]。腦缺血損傷的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，治療時(shí)間窗短，目前臨床治療效果不佳，腦缺血后神經(jīng)保護(hù)相關(guān)藥物的研究和開(kāi)發(fā)一直是腦缺血研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。近年來(lái)，隨著醫(yī)學(xué)、藥學(xué)以及相關(guān)學(xué)科的不斷發(fā)展，對(duì)腦缺血性疾病大規(guī)模的研究使得相關(guān)的治療方案和治療藥物不斷涌現(xiàn)，不過(guò)從目前的研究結(jié)果來(lái)看，很多藥物在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中有效，但是在臨床試驗(yàn)中卻不成功[2-4]。尋找新的作用靶點(diǎn)和藥物對(duì)腦缺血的臨床治療有重要意義。非轉(zhuǎn)移性黑色素瘤糖蛋白B(glycoprotein nonmetastatic melanoma protein B，GPNMB)在惡性黑色素瘤細(xì)胞等多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，屬于一種腫瘤生長(zhǎng)因子。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，腦缺血后小鼠的神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞分泌的GPNMB增多，該蛋白可能具有減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用[5]。本研究進(jìn)一步探討GPNMB對(duì)腦缺血再灌注小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性C57小鼠20只，由桂林醫(yī)學(xué)院動(dòng)物飼養(yǎng)中心提供(SYXK桂2020-0005)，體重200～250 g，采用普通小鼠飼料喂養(yǎng)，自由飲水，飼養(yǎng)環(huán)境為屏障級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。

1.2 藥劑與儀器 主要藥物有：異丙酚(AstraZeneca公司，批號(hào)：CL738)、磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS；北京生物制品研究所，國(guó)藥準(zhǔn)字S10850002)。主要儀器和設(shè)備有：美國(guó)Intramedic公司PE-50管,Phillip公司INTEGRIS CV型數(shù)字血管造影系統(tǒng)。

1.3 動(dòng)物分組與模型建立 按照隨機(jī)數(shù)字表法將20只小鼠分成PBS組和GPNMB組，每組10只。兩組小鼠均于術(shù)前24 h禁食，適量食水。使用10%的水合氯醛(350 mg/kg)進(jìn)行腹腔麻醉后，送入介入手術(shù)間，將小鼠仰臥位固定在手術(shù)臺(tái)上，鼻飼給氧，給予常規(guī)心電、呼吸和血壓監(jiān)護(hù)，使用微量泵靜脈注射異丙酚0.13 mL/h維持麻醉狀態(tài)。于麻醉狀態(tài)下建立大腦中動(dòng)脈栓塞模型：常規(guī)消毒頸部皮膚、備皮，切開(kāi)皮膚，分離皮下組織和肌肉，暴露頸總動(dòng)脈。結(jié)扎頸總動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，動(dòng)脈夾夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈，將準(zhǔn)備好的7-0尼龍線從頸外動(dòng)脈切口插入頸內(nèi)動(dòng)脈，松開(kāi)動(dòng)脈夾，將絲線頭端進(jìn)一步插至大腦中動(dòng)脈開(kāi)口處，建立大腦中動(dòng)脈阻塞模型?；謴?fù)灌注后，行大腦中動(dòng)脈正側(cè)位造影確認(rèn)栓塞成功，造影劑為優(yōu)維顯，濃度為300 mg/mL，購(gòu)自拜爾醫(yī)藥保健公司，經(jīng)頸外動(dòng)脈注入。術(shù)前、術(shù)中和術(shù)后24 h監(jiān)測(cè)小鼠的呼吸、體溫、血壓和血?dú)獾壬碇笜?biāo)。

1.4 干預(yù)方法 栓塞成功2 h后撤出尼龍線進(jìn)行再灌注2 h，GPNMB組經(jīng)栓塞側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈注射4 μL的GPNMB(濃度為50 ng/μL)，PBS組經(jīng)栓塞側(cè)頸動(dòng)脈注射等量的PBS后拔管、縫合包扎，再灌注24 h。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 梗死體積：給藥干預(yù)再灌注24 h后，按照隨機(jī)數(shù)字表法每組取5只小鼠，處死小鼠后取腦組織行冠狀位切片，每片厚度為2 cm。然后行2，3，5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)染色。將4 g TTC(美國(guó),Sigma公司)粉末溶于200 mL的PBS溶液，染色15 min，翻面再染10～15 min，甲醛溶液固定后測(cè)量梗死面積。正常腦組織呈紅色，梗死組織呈蒼白，通過(guò)病理圖文分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，測(cè)量每張切片的總面積和梗死面積，每層梗死體積為該層梗死面積和層厚的乘積，各層的梗死體積之和為總的梗死體積。計(jì)算梗死體積和對(duì)側(cè)正常腦組織的體積，其比值即為梗死率。

1.5.2 行為學(xué)觀察：取每組剩下的5只小鼠，進(jìn)行行為學(xué)觀察。分別于栓塞成功2 h后撤出尼龍線進(jìn)行再灌注2 h時(shí)與給藥干預(yù)再灌注24 h時(shí)，對(duì)小鼠進(jìn)行行為學(xué)缺陷評(píng)分。評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)參考相關(guān)文獻(xiàn)[6-7],評(píng)分為5分制，0分為無(wú)功能障礙，1分為不能伸展前肢，2分為向一側(cè)旋轉(zhuǎn)，3分為向一側(cè)傾倒，4分為無(wú)自主活動(dòng)伴意識(shí)抑制，5分為死亡。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組小鼠腦梗死體積的比較 干預(yù)再灌注24 h后，PBS組的腦梗死體積為(116.2±32.5 )mm3，腦梗死率為37.98%，GPNMB組的腦梗死體積為(67.3±21.3)mm3，梗死率為16.97%，GPNMB組的腦梗死體積小于PBS組(t=2.471,P=0.025)。見(jiàn)圖1。

圖1 兩組小鼠腦梗死體積的比較(TTC染色，×5)

2.2 兩組小鼠行為學(xué)缺陷評(píng)分的比較 栓塞再灌注后2 h與給藥干預(yù)再灌注后24 h時(shí)，PBS組的行為學(xué)缺陷評(píng)分均高于GPNMB組(均P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組小鼠行為學(xué)缺陷評(píng)分的比較(x±s，分)

3 討 論

急性缺血性腦卒中是一種因局限性腦缺血而突發(fā)的神經(jīng)功能障礙性疾病，以腦組織缺血及缺血性損傷癥狀為主要臨床表現(xiàn)，是全球人類致殘的首要病因，也是全球第二大死因，現(xiàn)已成為我國(guó)首要死因[1]。

GPNMB是一種由572個(gè)氨基酸組成的Ⅰ型跨膜蛋白，是一種腫瘤生長(zhǎng)因子，又被稱為骨活素、樹(shù)突細(xì)胞肝素整合素配體、造血干細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)神經(jīng)肽Ⅰ型[8]，在多種細(xì)胞中都有表達(dá)，如皮膚基底層細(xì)胞、免疫細(xì)胞、成骨細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞[9-10]。GPNMB具有多種作用，其在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，可以調(diào)節(jié)腫瘤的侵犯和轉(zhuǎn)移能力，抑制免疫系統(tǒng)，減少細(xì)胞凋亡，并有誘導(dǎo)血管再生，增強(qiáng)細(xì)胞黏附等作用，從而參與黑色素瘤、膠質(zhì)瘤、乳腺癌、肝癌等多種惡性腫瘤的生長(zhǎng)[5,11-13]。外源性的重組GPNMB可以增加小鼠成纖維細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶3的表達(dá)，其機(jī)制可能是激活了細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶途徑，參與細(xì)胞保護(hù)和炎癥調(diào)節(jié)[14]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，正常小鼠尿液中GPNMB表達(dá)水平極低，但腎缺血模型小鼠尿液中GPNMB的表達(dá)水平升高，且主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞內(nèi)，參與細(xì)胞吞噬和炎癥反應(yīng)[15]。還有研究表明，GPNMB陽(yáng)性表達(dá)的巨噬細(xì)胞具有更強(qiáng)的吞噬作用，以及清除壞死細(xì)胞碎片的能力，同時(shí)還分泌一些組織因子，對(duì)壞死組織的再生有明顯促進(jìn)作用[16-17]。以上研究表明，GPNMB可以通過(guò)參與炎癥反應(yīng)的調(diào)控、減少細(xì)胞死亡，參與腎缺血后的細(xì)胞保護(hù)機(jī)制。

Huang等[18]研究發(fā)現(xiàn)，GPNMB除了存在于膠質(zhì)瘤細(xì)胞外，在正常神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞內(nèi)也有表達(dá)，其主要由小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞合成和分泌，可通過(guò)激活T淋巴細(xì)胞、促進(jìn)其增殖；GPNMB可促進(jìn)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和吞噬細(xì)胞碎片，從而促進(jìn)細(xì)胞的自噬參與免疫與炎癥反應(yīng)；GPNMB可能是神經(jīng)系統(tǒng)疾病一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。還有研究結(jié)果顯示，GPNMB可以刺激巨噬細(xì)胞表達(dá)炎癥相關(guān)基因，發(fā)揮抗炎作用，從而起到神經(jīng)保護(hù)作用，由此可以推測(cè)GPNMB可作為神經(jīng)保護(hù)藥物的作用靶點(diǎn)[13,15,18-20]。Murata等[21]研究發(fā)現(xiàn)，GPNMB基因攜帶小鼠的記憶力優(yōu)于非攜帶小鼠，而且其海馬區(qū)域的離子型谷氨酸受體水平升高，這提示GPNMB可以促進(jìn)海馬區(qū)離子型谷氨酸受體的表達(dá)，達(dá)到增強(qiáng)記憶的作用，故其認(rèn)為GPNMB與神經(jīng)細(xì)胞代謝及腦功能有關(guān)。還有研究結(jié)果顯示，GPNMB在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá)，在肌萎縮性側(cè)索硬化癥患者腦脊液中的表達(dá)增高，高水平的GPNMB可以減輕運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的變性和萎縮，其作用機(jī)制與磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶和絲裂原活化蛋白激酶/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signal-regulated protein kinase，ERK)信號(hào)通路的激活有關(guān)，而該信號(hào)通路可以抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞[22]。Nakano等[5]研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血后，小鼠神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞分泌的GPNMB增多，GPNMB可以激活ERK1/2和蛋白激酶B信號(hào)通路，從而減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，縮小缺血后的腦梗死體積，這提示GPNMB可以作為腦缺血治療的新靶點(diǎn)。

本研究結(jié)果顯示，GPNMB組小鼠腦梗死體積小于PBS組，且栓塞再灌注后2 h、給藥干預(yù)再灌注后24 h時(shí)小鼠的行為學(xué)缺陷評(píng)分均低于PBS組(均P<0.05)，這提示GPNMB可以改善腦缺血再灌注小鼠的神經(jīng)功能缺血的癥狀。這一結(jié)果為GPNMB應(yīng)用于腦缺血治療提供更多的理論基礎(chǔ)，但GPNMB神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制如何，其通過(guò)哪些信號(hào)通路發(fā)揮作用，還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，GPNMB可以縮小腦缺血再灌注小鼠的腦梗死體積，并改善其梗死后行為學(xué)缺陷，但其具體的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。