楊美宇，劉赫迪，孫 蕾，孫源博，于建渤

(1.牡丹江醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院;2.黑龍江省腫瘤疾病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;3.牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院，黑龍江 牡丹江 157011)

膿毒癥主要由細(xì)菌感染，導(dǎo)致的急性腎損傷(Acute kidney injury,AKI)死亡率高達(dá)28%～90%[1]。脂多糖(Lpopolysaccharide,LPS)是一種由革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的內(nèi)毒素，廣泛用于構(gòu)建AKI模型，膿毒癥炎性因子產(chǎn)生及釋放、腎血流動(dòng)力學(xué)改變和細(xì)胞凋亡都參與AKI的發(fā)生[2]。降鈣素基因相關(guān)肽(Calcitonin gene related peptide,CGRP)一種生物活性肽，其具有明顯抗炎作用[3-4]。白藜蘆醇是一種天然非類黃酮多酚，其也具有抗氧化、抗炎、抗癌及心血管保護(hù)等作用[5]。SIRT1(Sirtuin1)可調(diào)節(jié)多種蛋白質(zhì)的功能，并證實(shí)其在多種腎臟疾病例如AKI中具有保護(hù)作用[6]。并有研究顯示，CGRP在AKI中可通過增加SIRT1的表達(dá)發(fā)揮其抗炎作用[7]。而白藜蘆醇經(jīng)證實(shí)也是SIRT1有效的化學(xué)激動(dòng)劑[5]。NLRP3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)是炎性小體中研究最多的，其在缺氧、細(xì)菌毒素等刺激下會(huì)促進(jìn)Caspase-1、IL-1β炎性因子釋放并促進(jìn)AKI進(jìn)展，而SIRT1具有抑制NLRP3的作用[8]。本研究通過構(gòu)建LPS膿毒性腎損傷大鼠模型，檢測(cè)CGRP和白藜蘆醇兩種藥物對(duì)大鼠模型治療效果;同時(shí)研究兩種藥物是否通過影響SIRT1/NLRP3的表達(dá)調(diào)節(jié)炎性因子釋放，從而起到治療作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 動(dòng)物 6周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠，共40只，體重(180～200)g，購于遼寧長生生物有限公司，恒溫恒濕[(22±1)°C、(50±1)%]，在實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物護(hù)理設(shè)施中進(jìn)行12 h光照/黑暗循環(huán)，可自由獲取食物和水。

1.1.2 試劑與儀器 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)購自美國Thermo公司;電熱鼓風(fēng)恒溫烘干箱購自上海新苗醫(yī)療器械公司;移液器購自德國Eppendorf公司;SpectraMax M3多功能酶標(biāo)儀購自美國Molecular Devices公司;LPS、CGRP、白藜蘆醇、鼠白細(xì)胞介素1β酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑盒、Western及IP細(xì)胞裂解液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;RNA提取試劑盒購自O(shè)mega公司;引物購自上海生工生物工程股份有限公司;八連管、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermo公司;兔抗鼠β-actin單克隆抗體、SIRT1、NLRP3及Caspase-1購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 建立動(dòng)物模型 40只大鼠自由攝取食物和水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為四組：以正常飼養(yǎng)未處理大鼠作為對(duì)照組;向大鼠腹腔內(nèi)注射LPS 10 mg/kg建立AKI大鼠模型，即LPS組;CGRP+LPS治療組：注射LPS前1周及后1 d腹腔注射CGRP 1 nmol/kg;白藜蘆醇+LPS治療組：注射LPS后6 h、12 h分別腹腔注射白藜蘆醇15 mg/kg。在所有藥物注射完畢后6 h，腹主動(dòng)脈取血后過量麻醉處死大鼠。

1.2.2 計(jì)算腎臟系數(shù)及影像學(xué)測(cè)量腎動(dòng)脈阻力指數(shù) 在大鼠清醒狀態(tài)下，使用動(dòng)物超聲儀器并選擇高頻探頭，同時(shí)利用彩色多普勒超聲觀察腎內(nèi)動(dòng)脈的血流信號(hào)及流速情況，測(cè)出收縮期峰速(PSV)和舒張末期血流速度(EDV)，并計(jì)算出腎動(dòng)脈阻力指數(shù)：(PSV-EDV)/PSV。處死大鼠后取出腎臟組織并計(jì)算腎臟系數(shù)。腎臟系數(shù)是指腎臟的濕重與單位體重的比值，通常是每100 g體重中腎臟所占的質(zhì)量，表為臟器重量(g)/體重(100 g)。

1.2.3 HE染色 取大鼠腎臟組織，將其置于4%多聚甲醛溶液中放置24 h，石蠟包埋，切片5 μm,脫蠟，常規(guī)逆梯度乙醇脫水，蘇木素-伊紅染色，再次順梯度乙醇浸泡，中性樹膠封固，顯微鏡下觀察并拍照。切片機(jī)制作石蠟切片，并將石蠟切片放在37 ℃的培養(yǎng)箱中放置24 h。

1.2.4 ELISA IL-1β、肌酐和尿素氮水平使用ELISA試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。使用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測(cè)量吸光度。

1.2.5 Western blot 使用RIPA裂解緩沖液裂解腎組織。使用BCA試劑盒定量蛋白質(zhì)濃度。通過10%聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)，蛋白上樣跑電泳，分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入稀釋后的一抗(β-actin、SIRT1、NLRP3及Caspase-1)4 °C冰箱孵育過夜，用TBST液漂洗3次，每次5 min，ECL顯影。每個(gè)樣本重復(fù)3次。應(yīng)用Image J軟件分析條帶灰度值，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS 22.0軟件、GraphPad Prism軟件通過單因素方差分析和LSD多重檢驗(yàn)分析結(jié)果，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組大鼠腎阻力指數(shù)、計(jì)算腎臟系數(shù)情況與對(duì)照組相比，LPS組腎臟系數(shù)及腎動(dòng)脈阻力指數(shù)增高(P<0.01);與LPS組相比，CGRP+LPS治療組、白藜蘆醇+LPS治組腎臟系數(shù)及腎動(dòng)脈阻力指數(shù)減低(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見l圖1、表1。

圖1 各組大鼠超聲影像

表1 四組大鼠腎臟系數(shù)、腎動(dòng)脈阻力指數(shù)情況

2.2 四組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)變化情況對(duì)照組腎小球結(jié)構(gòu)完整;LPS處理的腎組織中腎小球上皮細(xì)胞腫脹、間質(zhì)水腫，腎小管水腫;CGRP和白藜蘆醇處理顯著減輕LPS 誘導(dǎo)的腎小球和腎小管損傷,見圖2。

圖2 各組大鼠腎臟HE染色(×200)

2.3 四組大鼠血清肌酐和尿素氮情況結(jié)果顯示(如表2)，與對(duì)照組相比，LPS組血肌酐及尿素氮明顯升高(P<0.01);與LPS組相比，使用白藜蘆醇治療組，血清肌酐及尿素氮較LPS組有所降低(P<0.05);使用CGRP治療組血清肌酐及尿素氮較LPS組也有所降低(P<0.01)。

表2 四組大鼠腎血肌酐、尿素氮情況

2.4 IL-1β在四組大鼠血清及腎組織中表達(dá)情況結(jié)果顯示(如表3)，與對(duì)照組相比，LPS組血清及腎組織IL-1β表達(dá)升高(P<0.05);與LPS組相比，白藜蘆醇+LPS治療組血清及腎組織IL-1β表達(dá)降低(P<0.05);CGRP+LPS治療組血清及腎組織IL-1β表達(dá)降低(P<0.01)。

表3 四組大鼠血清、腎臟組織中IL-1β(pg/mL)表達(dá)情況

2.5 SRIT1、Caspase-1和NLRP3在四組大鼠腎組織中的表達(dá)結(jié)果顯示(如圖3、表4)，與對(duì)照組相比，LPS組中SRIT1表達(dá)降低，NLRP3、Caspase-1表達(dá)升高;與LPS組相比，CGRP+LPS組和白藜蘆醇+LPS組SRIT1表達(dá)升高，NLRP3、Caspase-1表達(dá)降低。以上差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。

圖3 Western blot檢測(cè)各組SIRT1、NLRP3及Caspase-1蛋白表達(dá)情況

表4 四組大鼠腎臟組織SRIT1、NLRP3、Caspase-1表達(dá)情況

3 討論

膿毒血癥是由感染引起全身性炎癥反應(yīng)。腎臟是受攻擊靶器官之一。膿毒癥所致AKI發(fā)病機(jī)制與腎血流動(dòng)力學(xué)異常、炎癥損傷、細(xì)胞凋亡和適應(yīng)性反應(yīng)密切相關(guān)[9]。本研究使用LPS處理大鼠模擬AKI。通過計(jì)算大鼠腎臟系數(shù)、腎阻力指數(shù)以及HE檢測(cè)發(fā)現(xiàn)LPS組腎臟系數(shù)及腎動(dòng)脈阻力指數(shù)增高、肌酐和尿素氮明顯升高、HE染色顯示LPS組腎小球和腎小管水腫損傷。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，經(jīng)LPS作用大鼠能夠較好模擬AKI。

CGRP參與許多生理和病理生理事件[10]。炎癥介質(zhì)和環(huán)境因素可以直接刺激CGRP釋放。Beihua等發(fā)現(xiàn)CGRP預(yù)處理可顯著改善缺血/再灌注誘導(dǎo)急性腎損傷。CGRP是目前已知最強(qiáng)血管擴(kuò)張劑，其改善LPS所致急性腎損傷可能是與增加腎血流量、改善腎臟缺血缺氧狀態(tài)有關(guān)。白藜蘆醇是一種多酚植物抗毒素并具有抗炎特性，經(jīng)證實(shí)，其對(duì)腎臟具有保護(hù)作用。本研究通過查閱文獻(xiàn)，分別選取CGRP和白藜蘆醇的最佳給藥方式，旨在研究兩種藥物是否對(duì)AKI大鼠模型起到治療效果，及可能機(jī)制。同時(shí)經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，腎阻力指數(shù)無論升高還是降低均不利于腎臟灌注，AKI大鼠模型經(jīng)CGRP和白藜蘆醇作用后，腎臟系數(shù)及腎動(dòng)脈阻力指數(shù)減低、肌酐和尿素氮降低、HE染色顯示腎小球和腎小管水腫損傷情況得到改善。結(jié)果提示，CGRP和白藜蘆醇能夠?qū)KI起到治療效果，我們推測(cè)兩者的治療作用通過緩解急性腎損傷所致的腎臟灌注不足介導(dǎo)的。

SIRT1在多種腎臟疾病(如AKI)中具有保護(hù)作用?？赏ㄟ^抑制促炎性細(xì)胞因子釋放抑制腎臟疾病進(jìn)展[11]。NLRP3炎性體是一種新發(fā)現(xiàn)的機(jī)制，可觸發(fā)各種炎癥反應(yīng)。SIRT1具有抑制NLRP3炎性體作用[12]。IL-1β是腎臟疾病中重要促炎指標(biāo)[13]，NLRP3炎癥小體激活可通過激活Caspase-1后促進(jìn)IL-1β成熟和分泌。在本研究中，AKI大鼠模型中SIRT1表達(dá)降低，NLRP3、IL-1β及Caspase-1表達(dá)升高，而使用CGRP和白藜蘆醇后逆轉(zhuǎn)上述情況。

綜上所述，經(jīng)過研究證實(shí)，CGRP和白藜蘆醇對(duì)AKI大鼠模型可以起到治療作用，提示CGRP和白藜蘆醇對(duì)緩解AKI炎性損傷可能有效。

除此，白藜蘆醇和CGRP對(duì)AKI治療作用可能通過調(diào)節(jié)SIRT1/NLRP3的表達(dá)，抑制炎性因子釋放，減少炎癥反應(yīng)介導(dǎo)的。另外，本實(shí)驗(yàn)有局限性，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，CGRP治療效果似乎優(yōu)于白藜蘆醇，但由于給藥時(shí)間不統(tǒng)一而無法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，因此無法得知其原因是由于CGRP預(yù)防性給藥還是CGRP對(duì)于AKI治療效果本身就優(yōu)于白藜蘆醇，這是值得進(jìn)一步探討。