余水紅，馬 軍，錢(qián) 燕 ，龔 莉

(1.安慶醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)?？蒲兄行?2.安慶市立醫(yī)院普外科;3.安慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽 安慶 246502)

胃癌 (Gastric cancer,GC) 是世界范圍內(nèi)發(fā)病率排名第五、死亡率排名第三的癌癥，中國(guó)2018年約有39萬(wàn)胃癌新發(fā)病例和37萬(wàn)死亡病例[1]。近些年來(lái)隨著對(duì)腫瘤分子生物水平研究的深入，分子靶向藥物提高了胃癌患者生存期。但由于胃癌具有易復(fù)發(fā)、易轉(zhuǎn)移及易耐藥等特性，晚期胃癌患者術(shù)后5年總生存率僅約為10%。

胃癌干細(xì)胞是具有干細(xì)胞特性的癌細(xì)胞，與癌癥的致癌、自我更新、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、耐藥等特性緊密相關(guān)[2]。胃癌干細(xì)胞的研究可為胃癌治療、提高患者生存質(zhì)量及生存總期提供新的方案，研究表明富含亮氨酸重復(fù)序列G-蛋白偶聯(lián)受體5 (leucine rich repeat -containing G-protei n coupled receptor 5,LGR5)、白細(xì)胞分化抗原分化簇第44號(hào) (cluster of differentia tion44,CD44)、異常紡錘體樣小頭畸形相關(guān)基因 (abnormal spindle-like,microce phaly associated,ASPM)、三磷酸腺苷結(jié)合盒跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G超家族成員2 (ATP-binding cassette subfamily Gmember2,ABCG2) 及前列腺干細(xì)胞抗原 (prostate stem cell antigen,PSCA) 是胃癌干性的標(biāo)志基因。LGR5可以通過(guò)激活胃腺癌細(xì)胞中的Wnt/catenin信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞增殖和侵襲[3]，CD44表達(dá)與胃癌復(fù)發(fā)與患者死亡率直接相關(guān)[4]，ASPM參與與胃粘膜癌變過(guò)程通路[5]，ABCG2介導(dǎo)胃癌耐藥機(jī)制[6]，PSCA抑制胃癌細(xì)胞增殖[7]。

本文借助多個(gè)在線腫瘤數(shù)據(jù)庫(kù)分析胃癌組織中5個(gè)典型干性基因的表達(dá)、變異及其與患者預(yù)后的關(guān)聯(lián)，同時(shí)多方位評(píng)估干性基因相關(guān)的基因網(wǎng)絡(luò)，并探討其在腫瘤免疫中的作用，為L(zhǎng)GR5、CD44、ASPM、ABCG2 及PSCA可能是胃癌診斷基因、治療靶點(diǎn)基因及預(yù)后潛在候選基因提供研究。

1 材料與方法

1.1 材料數(shù)據(jù)庫(kù)：UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)(http://ualcan.path.uab.edu)，Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.oncomine.org/)，Kaplan-Meier plotter 數(shù)據(jù)庫(kù) (http://kmplot.com/analysis)，cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.cbioportal.org/)，LinkedOmics 數(shù)據(jù)庫(kù) (http://www.linkedomics.org/login.php)，webgestalt數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.webgestalt.org/)，TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)(https://cistrome.shinyapps.io/ timer/)。

1.2 方法

1.2.1 UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)分析胃癌干性基因mRNA表達(dá)水平 在UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行TCGA數(shù)據(jù)集中分別檢索LGR5、CD44、ASPM、ABCG2 及PSCA，于數(shù)據(jù)庫(kù)選項(xiàng)中選擇胃癌，分析5種干性基因在胃癌組織與正常組織中mRNA的表達(dá)。

1.2.2 Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)分析胃癌干性基因DNA拷貝數(shù)水平 在Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)界面分別選擇(1)Gene：LGR5、CD44、ASPM、ABCG2 及PSCA;(2)Analysis type：cancer vs.normal analysis;(3)Cancer type：gastric cancer;(4)Date type：mRNA and DNA;(5)臨界值設(shè)定條件(Pvalue<0.05;gene rank：top 30%)，分析LGR5、CD44、ASPM、ABCG2 及PSCA干性基因在胃癌組織與正常組織中DNA拷貝數(shù)。

1.2.3 Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫(kù)分析胃癌干性基因與患者預(yù)后的關(guān)系 在Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇胃癌，基因框中同時(shí)輸入LGR5、CD44、ASPM、ABCG2 及PSCA，分析比較患者樣本高表達(dá)組及低表達(dá)組的生存預(yù)后。

1.2.4 cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)分析胃癌干性基因變異以及與患者預(yù)后的關(guān)系 在數(shù)據(jù)庫(kù)類(lèi)型中選擇“TCGA database”，腫瘤類(lèi)型選擇胃癌，基因選擇“LGR5、CD44、ASPM、ABCG2 及PSCA”，分析LGR5、CD44、ASPM、ABCG2 及PSCA在胃癌中的變異類(lèi)型、變異數(shù)目及變異與預(yù)后的關(guān)系。

1.2.5 Linked Omics數(shù)據(jù)庫(kù)分析胃癌干性基因及共表達(dá)基因網(wǎng)絡(luò) 在Linked Omics數(shù)據(jù)庫(kù)界面依次選擇(1)腫瘤類(lèi)型:選擇結(jié)胃癌;(2)數(shù)據(jù)類(lèi)型選擇RNAseq;(3)數(shù)據(jù)屬性：分別選擇GR5、CD44、ASPM、ABCG2 及PSCA;(4)靶數(shù)據(jù)類(lèi)型:選擇RNAseq;(5)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：選擇非參數(shù)檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)分析LGR5、CD44、ASPM、ABCG2 及PSCA干性基因的共表達(dá)基因，在火山圖和熱圖中顯示結(jié)果。

1.2.6 webgestalt數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)胃癌干性基因正負(fù)相關(guān)基因進(jìn)行功能注釋及KEGG通路分析 在webgestalt數(shù)據(jù)庫(kù)分別輸入LGR5、CD44、ASPM、ABCG2 及PSCA相關(guān)的基因，對(duì)LGR5、CD44、ASPM、ABCG2 及PSCA干性基因正負(fù)相關(guān)的500個(gè)基因進(jìn)行功能注釋及KEGG通路。

1.2.7 TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)分析胃癌干性基因與免疫細(xì)胞的關(guān)系 在TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)界面“Gene Symbol”框中分別輸入“LGR5、CD44、ASPM、ABCG2 及PSCAI”，“Cancer Types”選擇“STAD”，其余為默認(rèn)選項(xiàng)設(shè)，分析LGR5、CD44、ASPM、ABCG2 及PSCA干性基因在胃癌中的表達(dá)與免疫浸潤(rùn)的相關(guān)性，包括B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞以及腫瘤純度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)均來(lái)自以上數(shù)據(jù)庫(kù)，采用系統(tǒng)默認(rèn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，計(jì)算危險(xiǎn)比(Hazard Radio,HR)及95%置信區(qū)間(Confidence Interval,CI)，LongrankP<0.05檢驗(yàn)差異，LongrankP<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 胃癌干性基因在胃癌組織中的表達(dá)異常表達(dá)的基因是診斷腫瘤潛在的重要分子指標(biāo)，結(jié)果表明胃癌組織中LGR5、CD44及ASPM mRNA的表達(dá)高于相應(yīng)的正常組織 (P<0.05)，而ABCG2和PSCA mRNA水平在胃癌組織中的表達(dá)低于正常組織 (P<0.05) (圖1A～1E)。Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)表明LGR5、CD44、ASPM及PSCA的DNA拷貝數(shù)在腫瘤組織中明顯高于正常組織 (P<0.05)(圖1F～1I)，而ASPM表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此LGR5、CD44、ASPM和PSCA的表達(dá)可作為診斷GC潛在的指標(biāo)。

圖1 干性基因在胃癌組織和正常胃組織中的表達(dá)注：A：LGR5 mRNA的表達(dá);B：CD44 mRNA的表達(dá);C：ASPM mRNA的表達(dá);D：ABCG2 mRNA的表達(dá);E：PSCA mRNA的表達(dá);F：LGR5DNA拷貝數(shù);G：CD44 DNA拷貝數(shù);H：ASPM DNA拷貝數(shù);I：PSCA DNA拷貝數(shù)

2.2 胃癌干性基因與胃癌患者預(yù)后的相關(guān)性腫瘤患者預(yù)后是評(píng)估基因重要性的指標(biāo)之一，結(jié)果表明LGR5、CD44、ABCG2高表達(dá)組的總生存期明顯短于低表達(dá)組 (HR>1,P<0.05)，ASPM高表達(dá)組生存期明顯長(zhǎng)于對(duì)照組 (HR<1,P<0.05)，而PSCA表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的相關(guān)性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HR>1,P>0.05)(圖2A～2E)。因此LGR5、CD44、ASPM及ABCG2可作為患者預(yù)后候選基因。

圖2 干性基因的表達(dá)和胃癌患者總生存期的關(guān)系(Kaplan-Meier plotter)注：A：LGR5;B：CD44;C：ASPM;D：ABCG2;E：PSCA

2.3 胃癌干性基因在胃癌組織中的變異及類(lèi)型基因變異是腫瘤發(fā)生發(fā)展重要的內(nèi)在原因，結(jié)果顯示在369例患者中有104例發(fā)生胃癌干性基因變異，LGR5、CD44、ASPM、ABCG2 及PSCA擴(kuò)增性變異分別為7、18、3、1、21例，突變變異分別為12、7、35、6、2例，缺失變異分別為1、0、0、2、0例，mRNA上調(diào)分別為1、2、3、5、0例 (圖3)。LGR5、ASPM及ABCG2變異類(lèi)型最多的是突變變異，CD44及PSCA

圖3 干性基因在胃癌中的變異(cBioPortal)

最多的是擴(kuò)增性變異。ASPM變異可提高胃癌患者5年生存期，ABCG2變異不利于胃癌患者5年生存期，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05，圖4A、4B)，其他基因沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此ASPM和ABCG2的變異可能與胃癌的發(fā)生發(fā)展有密切的聯(lián)系。

圖4 ASPM及ABCG2變異對(duì)胃癌患者5年生存率的影響(cBioPortal) 注：A：ASPM變異與生存關(guān)系;B：ABCG2變異與生存關(guān)系

2.4 胃癌干性基因在胃癌中的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)胃癌干性基因潛在功能的發(fā)揮，可能是與多種基因共同作用的結(jié)果，火山圖顯示有1804、3251、5095、2332、5554個(gè)基因(紅點(diǎn))分別與LGR5、CD44、ASPM、ABCG2和PSCA呈顯著正相關(guān) (FDR<0.01)，而其中有477個(gè)、2279個(gè)、5352個(gè)、1843個(gè)、1659個(gè)基因 (黑點(diǎn)) 分別與之呈顯著負(fù)相關(guān)(FDR<0.01);正負(fù)相關(guān)的前50個(gè)關(guān)鍵基因熱圖如圖所示(圖5A～5E)。結(jié)果表明這些正負(fù)相關(guān)基因參與的生物學(xué)過(guò)程有生物調(diào)節(jié)、代謝過(guò)程、刺激反應(yīng)、多細(xì)胞生物過(guò)程等13類(lèi)過(guò)程;細(xì)胞組分主要集中在細(xì)胞膜、細(xì)胞核、細(xì)胞溶質(zhì)、膜封閉腔等21類(lèi);分子功能有蛋白結(jié)合、離子束縛、核酸結(jié)合等17類(lèi) (圖6A～6C,圖7A～7C)。通路分析結(jié)果表明干性基因及正相關(guān)的基因參與了驅(qū)動(dòng)蛋白、蛋白逆向運(yùn)輸、脂肪消化吸收及有絲分裂前中期等過(guò)程 (表1);干性基因及負(fù)相關(guān)的基因參與了平滑肌收縮、細(xì)胞周期各階段、肌肉收縮、磷酸代謝及幽門(mén)螺桿菌感染等過(guò)程 (表2)。富集分析有助了解LGR5、CD44、ASPM、ABCG2、PSCA及其相互作用基因在胃癌中的作用機(jī)理。

圖5 胃癌干性基因共表達(dá)基因 (LinkedOmics)注：A：LGR5相關(guān)基因火山圖與熱圖;B：CD44相關(guān)基因火山圖與熱圖;C：ASPM相關(guān)基因火山圖與熱圖;D：ABCG2相關(guān)基因火山圖與熱圖;E：PSCA相關(guān)基因火山圖與熱圖

圖6 胃癌干性基因和正相關(guān)基因的GO功能注釋(MetaScape)注：A：生物學(xué)過(guò)程;B：細(xì)胞組份;C：分子功能

圖7 胃癌干性基因和負(fù)相關(guān)基因的GO功能注釋(MetaScape)注：A：生物學(xué)過(guò)程;B：細(xì)胞組份;C：分子功能

表1 胃癌干性基因及正相關(guān)基因KEGG通路富集(MetaScape)

表2 胃癌干性基因及負(fù)相關(guān)基因KEGG通路富集(MetaScape)

2.5 胃癌干性基因在胃癌組織中與免疫細(xì)胞的關(guān)系腫瘤患者生存期與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)，利用TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)分析胃癌干性基因LGR5、CD44、ASPM、ABCG2 及PSCA在胃癌免疫微環(huán)境中的表達(dá)(圖8A～8E)，結(jié)果顯示這5個(gè)干性基因與腫瘤純度的關(guān)系分別為無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義、負(fù)相關(guān)、正相關(guān)、無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義、負(fù)相關(guān);LGR5、CD44及ASPM與B細(xì)胞的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，ABCG2 及PSCA與B細(xì)胞的表達(dá)呈正相關(guān);LGR5、ABCG2 及PSCA與CD8+T細(xì)胞的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，CD44、ASPM與CD8+T細(xì)胞的關(guān)系分別為正相關(guān)、負(fù)相關(guān);LGR5、CD44、ASPM、ABCG2與CD4+T細(xì)胞的表達(dá)呈正相關(guān)，PSCA與CD4+T細(xì)胞的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;LGR5、CD44、ASPM、ABCG2 及PSCA與巨噬細(xì)胞的表達(dá)的關(guān)系分別為無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義、正相關(guān)、負(fù)相關(guān)、正相關(guān)、無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;CD44與中性粒細(xì)胞及樹(shù)突狀細(xì)胞的表達(dá)呈正相關(guān)，ASPM呈負(fù)相關(guān)，LGR5、ABCG2 及PSCA均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。巨噬細(xì)胞及樹(shù)突狀細(xì)胞高表達(dá)不利于胃癌者5年(60個(gè)月)生存，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖9)，而B(niǎo)細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞及中性粒細(xì)胞與患者5年生存的關(guān)系無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。因此研究胃癌干性基因及免疫細(xì)胞可以為胃癌患者免疫治療提供參考。

圖8 干性基因與腫瘤免疫細(xì)胞間的相關(guān)性(TIMER)

圖9 高表達(dá)干性基因 mRNA的B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及樹(shù)突狀細(xì)胞對(duì)胃癌患者5年生存率的影響(TIMER)

3 討論

胃癌干細(xì)胞研究是胃癌治療中的研究熱點(diǎn)與重點(diǎn)，其中標(biāo)志干性基因LGR5、CD44、ASPM、ABCG2 及PSCA在胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用[5,10-17]，有望成為胃癌治療潛在的分子靶點(diǎn)來(lái)源。為能夠詳細(xì)了解LGR5、CD44、ASPM、ABCG2 及PSCA在胃癌中的潛在功能及其基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，本研究利用多個(gè)成熟的在線公共數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以期為干性基因在胃癌治療中的進(jìn)一步研究提供參考。

對(duì)胃癌干性基因轉(zhuǎn)錄分析表明其mRNA水平及DNA 拷貝數(shù)明顯異常于正常的胃癌組織，研究表明LGR5、CD44、ASPM 及PSCA在胃癌組織中mRNA相對(duì)表達(dá)與本文研究一致[5,7,18-19]，其中LGR5增強(qiáng)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移及耐藥能力，CD44增強(qiáng)化療或輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的耐受性，ASPM參與胃粘膜癌變過(guò)程，PSCA抑制胃癌細(xì)胞增殖。而ABCG2在胃癌細(xì)胞中相對(duì)表達(dá)較高且介導(dǎo)胃癌的耐藥機(jī)制[6]，PSCA基因mRNA水平及DNA 拷貝數(shù)在胃癌組織中表現(xiàn)不一致，ABCG2及PSCA在胃癌中DNA 拷貝數(shù)可能更多與與腫瘤細(xì)胞分裂有關(guān)，從而影響腫瘤發(fā)展;而RNA可能更多與腫瘤細(xì)胞合成蛋白分子有關(guān)，從而影響腫瘤的發(fā)生。

對(duì)胃癌干性基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析表明，異常表達(dá)的干性基因及正相關(guān)基因參與了細(xì)胞有絲分裂前中期、脂肪消化吸收及蛋白運(yùn)輸?shù)冗^(guò)程，負(fù)相關(guān)基因參與了細(xì)胞周期各階段、磷酸代謝及幽門(mén)螺桿菌感染等過(guò)程，這些發(fā)現(xiàn)與胃癌治療基礎(chǔ)研究的分子途徑基本一致[10,20]，但脂肪消化吸收過(guò)程是如何影響胃癌發(fā)生發(fā)展需要基礎(chǔ)研究深入探索。

基因變異是腫瘤發(fā)生發(fā)展的內(nèi)在原因之一，其可以破壞基因、改變基因編碼蛋白數(shù)量及種類(lèi)、導(dǎo)致表型差異[21]。本研究發(fā)現(xiàn)ASPM及ABCG2變異類(lèi)型最多的是突變變異，其中ASPM變異提高胃癌患者5年生存期，而ABCG2變異則縮短患者5年生存期。有研究表明胃癌中ASPM表達(dá)的改變導(dǎo)致其編碼的蛋白功能受到影響，隨之中間體功能出現(xiàn)缺陷使染色體分離的失敗導(dǎo)致腫瘤發(fā)生發(fā)展[22]。ABCG2可以作為Gli1的功能執(zhí)行基因，介導(dǎo)胃癌化療耐藥的發(fā)生，導(dǎo)致患者生存期縮短[23]。

腫瘤微環(huán)境是非癌細(xì)胞存在于腫瘤內(nèi)部或腫瘤周?chē)獠凯h(huán)境，免疫細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境重要組成部分，對(duì)基因的變異或選擇性表達(dá)具有重要的影響作用[24]，本研究表明5種胃癌干性基因與腫瘤微環(huán)境中的不同免疫細(xì)胞密切相關(guān)，很可能參與腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸和免疫抑制過(guò)程。

總之，本研究通過(guò)生物信息分析從多個(gè)層次探討這5種干性基因在胃癌中的作用。它們不僅在胃癌發(fā)生發(fā)展、診斷治療及患者預(yù)后方面非常重要，在免疫調(diào)節(jié)和免疫治療中也具有重要作用，但這些發(fā)現(xiàn)仍需要進(jìn)一步的胃癌基因組學(xué)及功能研究。