王 齊，劉梅梅，黃焱平，楊 珺

(安徽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，安徽 合肥 230601)

CA是一種水溶性酚酸類化合物，是咖啡酸和酒石酸的衍生物，存在于紫錐菊、菊苣、蒲公英等天然植物中。菊苣酸是一種有效的抗氧化藥物，能通過降低脂質(zhì)過氧化物以及細胞內(nèi)活性氧的積聚、清除自由基，發(fā)揮抗氧化損傷及心血管保護的藥理作用[1]。ALI的特征是彌漫性肺泡毛細血管內(nèi)皮損傷引起的肺水腫和肺擴張，表現(xiàn)為呼吸窘迫和難治性低氧血癥[2]。急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)是一種嚴重的ALI形式，可迅速發(fā)展為多器官衰竭，患者預(yù)后差[3]。雖然在ALI期間激素對炎癥反應(yīng)表現(xiàn)出顯著的抑制作用，但激素藥物在臨床使用中會導(dǎo)致不可預(yù)見的不良副作用。近年來臨床和實驗研究已經(jīng)證明，肺毛細血管屏障損傷后引發(fā)肺水腫加重是ALI/ARDS最重要的病理特征[4-5]。相關(guān)研究表明，菊苣酸可通過抑制淀粉樣蛋白積聚以及淀粉樣蛋白前體蛋白和神經(jīng)元分泌酶1水平的增加，來抑制脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的記憶障礙和神經(jīng)元丟失[6-7]。然而，CA對肺水腫的潛在影響及主要機制尚未有充分研究。因此，本文旨在闡明CA對大鼠模型中LPS引起的ALI和肺水腫的影響和相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和藥品雄性SD大鼠90只，體重(180～200) g,(6±1)周，由安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。飼養(yǎng)期間將動物安置在(24±1)℃、相對濕度為(50±1)%、光/暗周期為12 h的環(huán)境條件中。動物喂食標準谷物飼料，自由飲用自來水，飼養(yǎng)1周。菊苣酸由成都瑞芬思生物科技有限公司提供，純度>98%。徠卡熒光顯微鏡，德國Leica公司。722N分光光度儀，江蘇天睿精密科學(xué)儀器公司。超薄切片機，美國RMC。醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)BI2000，成都泰盟科技有限公司。電泳儀1704150，美國伯樂。LSRFortessa流式細胞分析儀，美國BD公司。

1.2 分組、造模和給藥將90只雄性SD大鼠隨機分為6組：假手術(shù)組、CA組、LPS組、低劑量CA組、中劑量CA組、高劑量CA組，每組15只。假手術(shù)組灌胃給予生理鹽水(5 mL/kg)1 h后，腹腔注射生理鹽水;CA組將CA(40 mg/kg)溶解于生理鹽水灌胃1 h后，腹腔注射生理鹽水;LPS組灌胃給予生理鹽水(5 mL/kg)1 h后，腹腔內(nèi)注射LPS(10 mg/kg);低劑量CA組給予溶解于生理鹽水CA(10 mg/kg)灌胃1 h后，腹腔注射LPS(10 mg/kg) ;中劑量CA組給予溶解于生理鹽水CA(20 mg/kg)灌胃1 h后，腹腔注射LPS(10 mg/kg);高劑量CA組給予溶解于生理鹽水CA(40 mg/kg)灌胃1 h后，腹腔注射LPS(10 mg/kg);LPS注射6 h后，腹腔注射2%的青藤巴比妥(60 mg/kg)麻醉大鼠。

1.3 HE染色和免疫組織化學(xué)檢測

1.3.1 HE染色 LPS給藥6 h后，麻醉安樂死大鼠取右肺中葉，4%多聚甲醛4 ℃固定48 h，進行石蠟切片(5 μm)。在二甲苯和乙醇梯度分離后，在室溫下用蘇木精染色5 min，伊紅染色15 s。在光學(xué)顯微鏡物鏡(×10)下觀察肺組織的形態(tài)學(xué)變化。

1.3.2 髓過氧化物酶(MPO)免疫組化染色 麻醉安樂死大鼠取右肺中葉，4%多聚甲醛4 ℃固定48 h，進行石蠟切片(5 μm)。切片用梯度酒精脫水，二甲苯透明后在0.01 M檸檬酸緩沖液(pH 6.0)中微波爐加熱修復(fù)抗原，并在室溫下過氧化氫(0.3%)封閉30 min。滴加兔MPO多克隆一抗(1∶200;Abcam)在4 ℃孵育過夜。然后將切片與生物素標記的山羊抗兔IgG二抗(HRP)在室溫下孵育30 min，并使用DAB底物試劑盒觀察顯色情況。在光學(xué)顯微鏡物鏡下(×20)觀察肺組織樣本中MPO陽性細胞的位置和表達水平。

1.4 測定肺干濕重比注射LPS 6 h后，麻醉安樂死大鼠，取右上葉肺組織各100 mg，稱重。在80 ℃的真空烘箱中干燥48 h，再次稱重肺組織。計算烘干前后肺重量的比值。

1.5 肺血管通透性檢測大鼠腹腔注射LPS 6 h后，注射2%的青藤巴比妥(60 mg/kg)麻醉大鼠，再將2%伊文思藍(EB)溶液(30 mg/ kg)從大鼠頸內(nèi)靜脈注入。30 min后，通過右心室用生理鹽水灌注，直到心臟驟停，沖洗肺組織中的血管內(nèi)EB，收集每只大鼠的部分左下葉肺組織，稱重并放于離心管中。將100 mg左下葉肺組織加入1 mL甲酰胺，放置在37 ℃的水浴中24 h，在室溫下離心30 min，然后提取上清液。用620 nm波長的分光光度計測量上清液的吸光度值。采用標準曲線法計算每個樣品的EB含量。肺微血管通透性以EB含量與濕肺重之比表示。

1.6 支氣管肺泡灌洗液(BALF)的收集和分析腹腔注射LPS后6 h，麻醉大鼠，氣管內(nèi)插入塑料套管，無菌生理鹽水抽吸收集BALF，共3次。BALF樣品在4 ℃下離心10 min，提取上清液。采用BCA法檢測BALF樣品中的總蛋白濃度。在室溫下用Wright-Giemsa染色1 min，使用細胞計數(shù)評估細胞總數(shù)，并在物鏡(×4)下觀察。

1.7 Western blot分析腹腔注射LPS后6 h，麻醉安樂死大鼠，取右肺上葉組織，采用一步RIPA法從大鼠肺組織中提取總蛋白后采用BCA法測定蛋白含量。經(jīng)過8%SDS-PAGE電泳(每組100 mg蛋白質(zhì))分離后，將蛋白質(zhì)樣品轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%脫脂牛奶在室溫下密封1 h。使用的主要抗體和濃度如下：ZO-1(1∶1000，Thermo Fisher Scientific公司)，Occludin(1∶500，Thermo Fisher Scientific公司)、JAM-1(1∶1000，Santa Cruz Biotechnology公司)和GAPDH(1∶5000，Cell Signaling Technology公司)。所有一抗在4 ℃下孵育過夜。以GAPDH為內(nèi)參。Western blot條帶的平均光密度采用Quantity One圖像分析軟件測定，計算目標帶的平均光密度與GAPDH的平均光密度的比值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析計量資料以“均數(shù)±標準差”表示。使用SPSS 15.0進行ANOVA方差分析和Tukey檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CA抑制LPS誘導(dǎo)的大鼠ALI和肺部炎癥HE染色結(jié)果顯示，在假手術(shù)組和CA組中，大鼠肺結(jié)構(gòu)顯示肺泡腔完全透明，肺泡間隔內(nèi)無水腫或炎癥細胞浸潤。而LPS組肺間質(zhì)組織明顯水腫增厚(圖1 A，箭頭)，并伴有肺泡萎縮。CA預(yù)處理防止了LPS誘導(dǎo)的ALI和對肺泡結(jié)構(gòu)的損傷(圖1 A和B)。免疫組化檢測顯示與假手術(shù)組和CA組相比，注射LPS后大鼠肺組織中MPO陽性細胞染色明顯增加。與LPS組相比，CA預(yù)處理組的MPO陽性染色較弱(圖1 C和D)。這表明CA阻止了LPS誘導(dǎo)的白細胞浸潤和大鼠肺組織損傷。

圖1 CA對LPS注射后急性肺組織損傷及肺組織MPO表達水平的影響注：A：各組大鼠肺組織HE染色圖像(標尺，200 μm)，箭頭表示間質(zhì)水腫和增厚(×40);B：各組大鼠肺組織MPO免疫組化圖像(×40)(標尺，200 μm);C：肺損傷量化評分;D：各組肺組織中MPO陽性細胞的統(tǒng)計分析;與假手術(shù)組比較，*P<0.05;與LPS模型組比較，#P<0.05

2.2 CA防止LPS誘導(dǎo)的肺微血管通透性和肺水腫與假手術(shù)組相比，大鼠腹腔注射LPS6 h后肺組織濕干重比顯著增高，表明肺組織水腫顯著增加。LPS組與假手術(shù)組相比，肺組織EB外滲和BALF蛋白含量也顯著升高，提示LPS破壞了肺血管和肺泡上皮屏障的完整性。此外注射LPS后BALF的總細胞數(shù)量也顯著增加。與LPS組相比，中劑量CA組和高劑量CA組的肺濕/干重比、EB外滲、BALF蛋白濃度和BALF總細胞數(shù)均顯著降低(表1)。這些數(shù)據(jù)表明，CA預(yù)處理可有效抑制LPS誘導(dǎo)的肺水腫，并增加肺微血管通透性。

表1 CA對脂多糖誘導(dǎo)的肺微血管通透性和肺組織水腫的影響

2.3 CA抑制LPS誘導(dǎo)的大鼠肺組織緊密連接蛋白的下調(diào)Western blotting結(jié)果表明，LPS誘導(dǎo)后大鼠肺組織中緊密連接蛋白ZO-1、Occludin和JAM-1的表達水平顯著降低(圖2和表2)。在CA 20 mg/kg和40 mg/kg劑量組中，肺組織緊密連接蛋白表達量顯著高于LPS組。這說明CA對LPS引起的肺緊密連接蛋白表達的降低有一定的抑制作用。

圖2 Western blotting檢測大鼠肺組織ZO-1、Occludin和JAM-1的定量分析圖

表2 大鼠肺組織中ZO-1、Occludin和JAM-1的定量分析

3 討論

最近的研究表明，肺微血管屏障損傷和由此引起的肺水腫是早期ALI的主要病理特征，是治療ALI/ARDS的關(guān)鍵靶點[8-9]。研究顯示脂多糖作為革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分是引起肺損傷的常見原因，因此在實驗研究中被廣泛用于建立ALI動物模型[10]。LPS通過與白細胞Toll樣受體4結(jié)合激活NF-κB，誘導(dǎo)多種炎癥因子的表達，包括TNF-α、IL-1β和IL-6，導(dǎo)致細胞旁連接的破壞[11]。因此粘附在血管壁上的白細胞通過釋放蛋白酶和過氧化物破壞微血管，使肺微血管通透性增加并引起肺水腫，最終導(dǎo)致肺順應(yīng)性降低和肺功能受損。

本研究表明，CA預(yù)處理可以阻止LPS誘導(dǎo)的大鼠ALI，使MPO的表達水平降低，細胞因子的產(chǎn)生下降，下調(diào)LPS炎癥肺組織中粘附分子的表達。本研究表明了CA可以抑制LPS誘導(dǎo)的炎性細胞的浸潤并降低MPO表達的上調(diào)。LPS除了通過白細胞過度活化間接損害血管外，還直接損害微血管屏障功能，導(dǎo)致微血管通透性增加和肺水腫[12]。本研究結(jié)果顯示，與LPS組相比，CA預(yù)處理組的肺組織濕干重比、BALF蛋白含量和EB外滲率均明顯下降，說明CA可以抑制LPS誘導(dǎo)的肺微血管的通透性以及肺水腫。微血管屏障主要由微血管內(nèi)皮細胞之間的緊密和粘附連接調(diào)節(jié)。緊密連接蛋白包括Claudin，Occludin和JAM通過與細胞質(zhì)中的ZO家族蛋白連接，在穩(wěn)定細胞間緊密相互作用中發(fā)揮關(guān)鍵作用[13]。CA不僅可以穩(wěn)定肺微血管緊密連接蛋白Occludin的表達，還可以增加JAM-1和ZO-1蛋白的表達水平。CA通過增加連接蛋白的表達水平來影響肺組織中的微血管屏障，防止LPS誘導(dǎo)的肺微血管通透性增高和肺組織水腫。

綜上所述，CA對LPS誘導(dǎo)的大鼠ALI具有保護作用并與減少肺組織微血管屏障的破壞有密切關(guān)系。