周萍 肖華 李勇輝 董昕文

(1 湖南師范大學(xué)教育科學(xué)學(xué)院心理學(xué)系,長沙 410018) (2 中國科學(xué)院心理研究所心理健康重點實驗室,北京 100101)(3 中國科學(xué)院大學(xué)心理學(xué)系,北京 100049)

1 引言

應(yīng)激刺激是對機體的生存、繁衍過程有傷害或干擾的刺激,能夠誘發(fā)機體的應(yīng)激反應(yīng)以降低應(yīng)激刺激造成的傷害。當(dāng)應(yīng)激刺激的強度過大,超出應(yīng)激系統(tǒng)的承受能力,達(dá)到創(chuàng)傷應(yīng)激程度,則會打破應(yīng)激系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)(McEwen,2017),使機體產(chǎn)生持續(xù)的過度反應(yīng),出現(xiàn)急性應(yīng)激障礙、創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙等應(yīng)激相關(guān)精神障礙(American Psychiatric Association,2013)。

喚醒狀態(tài)持續(xù)處于高水平是創(chuàng)傷應(yīng)激引起的過度應(yīng)激反應(yīng)之一,對創(chuàng)傷相關(guān)記憶的闖入性回憶、負(fù)性心境、情緒麻木等心理癥狀有預(yù)測性(Bryant et al.,2008,2017;Gelkopf et al.,2019)。高喚醒癥狀的強度和表現(xiàn)受到創(chuàng)傷類型和強度的影響,如暴力傷害比意外事故能引起更嚴(yán)重的高喚醒癥狀(Agarwal et al.,2020),但是也有研究發(fā)現(xiàn),高喚醒癥狀相比其他PTSD 癥狀,在不同創(chuàng)傷類型之間變異性更低(Boal et al.,2017)。應(yīng)激引起的高喚醒狀態(tài)受到多個神經(jīng)化學(xué)系統(tǒng)的調(diào)節(jié),包括去甲腎上腺素系統(tǒng)、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)系統(tǒng)、應(yīng)激激素系統(tǒng)及其它多個神經(jīng)肽系統(tǒng)(Stam,2007)。其中5-HT 對慢性高喚醒癥狀有重要作用(Young,2013)。5-HT 是一種單胺類神經(jīng)遞質(zhì),又稱血清素,分泌5-HT 的細(xì)胞胞體主要位于腦干中縫核,并投射到多個應(yīng)激相關(guān)的前腦區(qū)域,包括杏仁核、終紋床核、海馬和前額葉(McQuade &Sharp,2002)。5-HT 不僅參與調(diào)節(jié)睡眠、覺醒狀態(tài)(Monti,2011),還參與調(diào)節(jié)應(yīng)激引起的喚醒上升(Linthorst&Reul,2008;Wankhar et al.,2020)。在中等應(yīng)激強度下,5-HT 在前額葉的釋放可以減少煩躁不安和焦慮(Sherin &Nemeroff,2011),嚴(yán)重的創(chuàng)傷應(yīng)激則會導(dǎo)致5-HT 系統(tǒng)短時間內(nèi)過度激活,隨后導(dǎo)致5-HT的耗竭(Kaehler et al.,2000),出現(xiàn)煩躁不安、易激惹、注意力不集中等高喚醒表現(xiàn)(Young,2013)。當(dāng)前對于5-HT 與高喚醒關(guān)系的研究很少,作用機制不明確。

基于動物模型對創(chuàng)傷應(yīng)激反應(yīng)進(jìn)行的研究,通常采用兩類應(yīng)激方式,分別是心理應(yīng)激方式,比如天敵或天敵氣味暴露、(無接觸的)社交挫敗等,和生理與心理應(yīng)激相結(jié)合的應(yīng)激方式,比如束縛、電擊、水下應(yīng)激等(Stam,2007;T?r?k et al.,2019)。目前沒有研究系統(tǒng)對比過動物模型中應(yīng)激類型對高喚醒狀態(tài)的強度和持續(xù)時間的影響。高喚醒的具體表現(xiàn)包括心率、血壓等心血管活動提高,入睡困難或睡眠維持困難,注意力無法集中,易激惹,持續(xù)的驚嚇反射上升等。其中驚嚇反射(startle reflex)是個體對外界突發(fā)性強刺激作出的防御反射,表現(xiàn)為面部與軀干肌肉的快速收縮。相比其它高喚醒的生理或行為表現(xiàn),驚嚇反射用于實驗研究具有諸多優(yōu)點,包括在哺乳動物中廣泛存在,反應(yīng)幅度相對穩(wěn)定,可反復(fù)測試而沒有明顯的習(xí)慣化現(xiàn)象,測量方法簡單易操作,因此是反映高喚醒程度的穩(wěn)定客觀指標(biāo)(Lang et al.,1990),適用于前臨床研究和臨床轉(zhuǎn)化研究。

本研究關(guān)注5-HT 在創(chuàng)傷應(yīng)激造成的持續(xù)高喚醒狀態(tài)中的調(diào)節(jié)作用,基于實驗室先前建立的創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙動物模型(Dong &Li,2014),通過測量驚嚇反射幅度反映喚醒水平,采用色氨酸羥化酶(tryptophan hydroxylase,Tph)基因缺失小鼠考察不同5-HT 水平對創(chuàng)傷引起的高喚醒的影響。Tph是將色氨酸轉(zhuǎn)化為 5-羥色氨酸的催化酶,共有Tph1 和Tph2 兩種亞型,中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)以Tph2為主(Walther et al.,2003)?；蛲耆贸?-/-)的小鼠腦內(nèi) 5-HT 合成減少約 95%(Gutknecht et al.,2012;Liu et al.,2011),極易夭折,健康狀態(tài)差。雜合型(+/-)小鼠腦內(nèi)5-HT 合成減少約20%～25% (Liu et al.,2011),沒有明顯的健康問題。因此,本研究采用雜合型基因缺失小鼠,與野生型小鼠對比,并采用純心理應(yīng)激(天敵暴露應(yīng)激)和生理心理應(yīng)激相結(jié)合(足底電擊應(yīng)激)兩種應(yīng)激方式,考察5-HT 降低對創(chuàng)傷應(yīng)激引起的高喚醒的產(chǎn)生、發(fā)展的作用,同時考察其中的性別差異。

2 實驗材料和方法

2.1 實驗動物

實驗采用野生型小鼠和基因缺失的雜合型(+/-)小鼠共136只,其中雄性野生型小鼠26只,雌性野生型小鼠35 只,雄性+/-小鼠40只,雌性+/-小鼠 35 只。野生型小鼠為C57/BL6J 型小鼠,+/-小鼠遺傳背景同為C57/BL6J,從北京大學(xué)實驗動物中心購入,購入時體重23～26 g,10 周齡。購入后在中國科學(xué)院心理研究所動物實驗平臺進(jìn)行繁育。小鼠出生后21 天,進(jìn)行基因鑒定,然后根據(jù)基因型分籠飼養(yǎng),每盒2～5 只。實驗均在光照期進(jìn)行(8:00 至20:00),溫度21～24 ℃,濕度40%～60%。實驗期間保持動物自由進(jìn)食和飲水,每周至少更換一次墊料。正式實驗開始前,實驗人員對小鼠進(jìn)行抓取、撫摸等操作,每次5 分鐘,每天一次,連續(xù)進(jìn)行7 天,使其適應(yīng)實驗人員操作。所有實驗操作符合《實驗動物管理條例》,并且經(jīng)中國科學(xué)院心理研究所倫理委員會審核通過。

2.2 實驗基本流程與分組

所有小鼠在適應(yīng)實驗人員操作一周后進(jìn)行聽覺驚嚇反射測試,每天一次,共兩次。第一次測試作為動物適應(yīng)測試環(huán)境和測試過程的適應(yīng),數(shù)據(jù)未進(jìn)行統(tǒng)計。根據(jù)第二次驚嚇反射測試基線值,對所有小鼠進(jìn)行偽隨機平衡分組,不同組動物在兩天后接受不同應(yīng)激處理,分別為無應(yīng)激組(控制組)、天敵暴露應(yīng)激組(天敵組)、足底電擊應(yīng)激組(電擊組)。其中,野生型雄鼠控制組8 只,天敵組9 只,電擊組9 只;+/-雄鼠控制組13 只,天敵組13 只,電擊組14 只;野生型雌鼠控制組12 只,天敵組12只,電擊組11 只;+/-雌鼠控制組12 只,天敵組12 只,電擊組11 只。由于部分小鼠在接受天敵應(yīng)激時受到天敵(貓)的直接攻擊,實際納入數(shù)據(jù)分析的天敵應(yīng)激組動物數(shù)量為：雄性野生型9 只,雄性+/-型10 只,雌性野生型8 只,雌性+/-型6 只。在應(yīng)激后不同時間點,對所有動物進(jìn)行多次聽覺驚嚇反射測試,分別為應(yīng)激后1 天、2 天、10 天、18 天,考察不同應(yīng)激誘發(fā)的聽覺驚嚇反射幅度變化過程。

2.3 基因型鑒定方法

從鼠尾末端組織中提取DNA,采用以下序列的引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增：5′-GGGCATCTCAGGACGTAGTAG;5′-GGGCCTGCCGATAGTAA CAC;5′-GCAGCCAGTAGACGTCTCTTAC;之后根據(jù)凝膠電泳成像結(jié)果判斷小鼠基因型。

2.4 應(yīng)激方法

無應(yīng)激組(控制組)小鼠,轉(zhuǎn)移至非飼養(yǎng)間的實驗室中,在與飼養(yǎng)盒相似大小的盒中獨處10 分鐘,回到原飼養(yǎng)盒。

天敵暴露應(yīng)激組(天敵組)小鼠,被放入貓所在的敞口開放空間(2 m × 1 m × 1 m),實驗人員在旁邊監(jiān)控,如果二者間距離小于20 cm 則立即將小鼠轉(zhuǎn)移至空間內(nèi)遠(yuǎn)離貓的位置,避免直接接觸及可能的軀體傷害。部分小鼠受到貓的直接攻擊,未納入后續(xù)測試和數(shù)據(jù)分析(詳見2.2)。5 分鐘后取出小鼠,回到飼養(yǎng)間。

足底電擊應(yīng)激組(電擊組)小鼠,被放入電擊箱(30 cm × 30 cm × 27 cm,天鳴宏遠(yuǎn)科技發(fā)展有限公司),3 分鐘后接受第一次足底電擊,電流強度1.5 mA,持續(xù)5 秒,共接受5 次電擊,間隔60～120 s,最后一次電擊后,在電擊箱中停留1 分鐘,之后放回到飼養(yǎng)盒。電擊箱采用5%酒精清潔。

2.5 聽覺驚嚇反射測試

聽覺驚嚇反射通過聽覺驚反射系統(tǒng)(San Diego Instruments 公司)進(jìn)行測量。從飼養(yǎng)盒取出小鼠,放入適配小鼠的固定盒,將固定盒放入隔音箱中,隔音箱內(nèi)揚聲器持續(xù)播放65 dB 白噪音直至實驗結(jié)束。進(jìn)入隔音箱5 分鐘后,給予90 dB、100 dB、110 dB,持續(xù)50 ms 的白噪音刺激各10 次,刺激順序隨機,刺激間隔10～50 s 隨機。通過小鼠固定盒底部的加速度傳感器,記錄小鼠在聲音刺激開始前200 ms 到聲音結(jié)束后1000 ms 的重力變化,采樣率為每秒1000 次。結(jié)束后,取出小鼠,放回到飼養(yǎng)籠,用5%酒精清潔動物固定盒。

2.6 統(tǒng)計分析

使用R 1.70 和RStudio 1.3.959 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。由于多數(shù)小鼠在90 dB 噪音刺激下沒有出現(xiàn)明顯的驚嚇反射反應(yīng),沒有將90 dB 條件下的驚嚇反射反應(yīng)納入統(tǒng)計分析,而采用了100 dB 和110 dB誘發(fā)的驚嚇反射的平均值。對雄性和雌性小鼠的聽覺驚嚇反射幅度分別進(jìn)行三因素混合方差分析(基因型×應(yīng)激類型×測量時間,測量時間為重復(fù)測量因素),并進(jìn)行事后檢驗和簡單效應(yīng)分析(均采用TukeyHSD 校正),以＜ 0.05 為差異顯著標(biāo)準(zhǔn),并報告效應(yīng)量η和95%置信區(qū)間。

3 結(jié)果

3.1 性別、基因型對小鼠聽覺驚嚇反射基線水平的影響

應(yīng)激前對所有動物進(jìn)行了聽覺驚嚇反射測量,考察性別、基因型(野生型或+/-)對聽覺驚嚇反射幅度的影響。組間方差分析結(jié)果顯示,性別主效應(yīng)顯著((1,119)=18.6,＜ 0.001,η=0.135,圖1),雄性動物的驚嚇反射幅值顯著大于雌性動物,95% CI=[36.5,99.5],基因型主效應(yīng)不顯著,性別與基因型的交互作用不顯著。根據(jù)基線測試結(jié)果,對不同性別、不同基因型的小鼠進(jìn)行平衡分組,分別接受不同類型應(yīng)激刺激。

圖1 性別、基因型對小鼠聽覺驚嚇反射幅值的影響

3.2 Tph2 基因?qū)π坌孕∈髴?yīng)激后聽覺驚嚇反射的影響

基于驚嚇反射基線值對不同基因型小鼠進(jìn)行平衡分組后,分別進(jìn)行了天敵暴露應(yīng)激、足底電擊應(yīng)激及無應(yīng)激操作,并在1 天、2 天、10 天、18 天后進(jìn)行4 次聽覺驚嚇反射測試。以測量時間為重復(fù)測量變量,應(yīng)激類型和基因型為組間變量,分別對不同性別小鼠的驚嚇反射幅值進(jìn)行了方差分析。

結(jié)果顯示,應(yīng)激類型對雄性小鼠驚嚇反射反應(yīng)幅度有顯著影響((2,57)=7.17,=0.002,η=0.09,圖2),在天敵暴露應(yīng)激和電擊應(yīng)激后均出現(xiàn)了驚嚇反射上升(天敵組與控制組,=0.001,95%CI=[22.6,109.0];電擊組與控制組,＜ 0.001,95%CI=[53.0,136.0]);基因型主效應(yīng)不顯著;基因型與應(yīng)激類型交互作用顯著,(2,57)=3.20,=0.048,η=0.043。進(jìn)一步的簡單效應(yīng)分析顯示,經(jīng)歷電擊應(yīng)激的雄性+/-小鼠相比控制組和天敵應(yīng)激組,聽覺驚嚇反射幅度更高(電擊組與控制組,＜ 0.001,95% CI=[63.5,192.0];電擊組與天敵組,=0.022,95% CI=[6.76,145.0]),而不同應(yīng)激處理組的野生型雄性小鼠驚嚇反射幅值無差異(＞ 0.05)。不同測量時間驚嚇反射有顯著變化,(3.37,192.34)=20.4,＜ 0.001,η=0.18 (圖2)。對應(yīng)激效果的簡單效應(yīng)分析顯示,在應(yīng)激后1 天、2天、10 天,電擊組雄性+/-小鼠的驚嚇反射幅值均顯著高于控制組(應(yīng)激后1 天,=0.031,95%CI=[13.0,312];應(yīng)激后2 天,＜ 0.001,95% CI=[84.4,325];應(yīng)激后10 天,=0.002,95% CI=[68.3,311]),天敵組雄性+/-小鼠與控制組在各個時間點無顯著差異;野生型小鼠,僅在應(yīng)激后1 天,天敵應(yīng)激組驚嚇反射顯著高于控制組(=0.025,95% CI=[22.6,374]),在其它時間點天敵組和電擊組小鼠的驚嚇反射幅值均與控制組無顯著差異。對基因型影響的簡單效應(yīng)分析顯示,在應(yīng)激后第10天,經(jīng)足底電擊的雄性+/-小鼠驚嚇反射幅值顯著高于野生型(=0.010,95% CI=[42.4,283]),其他時間點各處理組之間不同基因型小鼠驚嚇反射無顯著差異(＞ 0.05)。上述結(jié)果說明,+/-小鼠在電擊應(yīng)激后產(chǎn)生了持續(xù)10 天以上的驚嚇反射上升表現(xiàn);基因型對應(yīng)激引起的驚嚇反射幅度上升的影響表現(xiàn)在應(yīng)激后數(shù)天,而非即刻影響。

圖2 雄性小鼠在應(yīng)激前后聽覺驚嚇反射幅值變化

3.3 Tph2 基因?qū)Υ菩孕∈髴?yīng)激后聽覺驚嚇反射的影響

不同于雄性小鼠在應(yīng)激后出現(xiàn)明顯的驚嚇反射上升現(xiàn)象,雌性小鼠在天敵或電擊應(yīng)激后均沒有明顯的驚嚇反射變化,不同基因型間無差異,但是應(yīng)激刺激、基因型與測試時間三者之間存在顯著的交互作用,(6.16,166.39)=2.62,=0.018,η=0.027 (圖3)。進(jìn)一步的簡單效應(yīng)分析顯示,在應(yīng)激后10 天,接受天敵應(yīng)激的雌性+/-小鼠驚嚇反射幅值顯著高于野生型(=0.021,95% CI=[20.5,207]);其他時間點,各個應(yīng)激組的不同基因型小鼠之間無顯著差異。上述結(jié)果說明,雌性小鼠在天敵暴露應(yīng)激和足底電擊應(yīng)激后早期(應(yīng)激后1天)沒有出現(xiàn)明顯的驚嚇反射幅度變化,天敵應(yīng)激后10天+/-小鼠有驚嚇反射小幅上升現(xiàn)象。

圖3 雌性小鼠在應(yīng)激前后聽覺驚嚇反射幅值變化

4 討論

本研究關(guān)注5-HT 對創(chuàng)傷應(yīng)激誘發(fā)的高喚醒的影響,通過天敵暴露和足底電擊兩種創(chuàng)傷應(yīng)激手段,以聽覺驚嚇反射作為喚醒水平客觀指標(biāo),對比了5-HT 合成酶基因缺失小鼠與野生型小鼠在創(chuàng)傷應(yīng)激后急性與慢性高喚醒反應(yīng)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),雄性野生型小鼠在創(chuàng)傷應(yīng)激后出現(xiàn)明顯的急性高喚醒表現(xiàn),隨后逐漸恢復(fù),慢性反應(yīng)不明顯,而雄性基因缺失小鼠在創(chuàng)傷應(yīng)激后不僅有明顯的急性高喚醒表現(xiàn),并且能持續(xù)10 天以上,具有一定程度的慢性高喚醒,體現(xiàn)了基因與環(huán)境的交互作用;雌性小鼠的驚嚇反射幅度明顯低于雄性小鼠,野生型小鼠在創(chuàng)傷應(yīng)激后沒有表現(xiàn)出驚嚇反射水平波動,雌性基因缺失小鼠在天敵暴露應(yīng)激后有相對較弱的慢性喚醒上升表現(xiàn)。

對雄性小鼠應(yīng)激前后多次聽覺驚嚇反射測量結(jié)果顯示,+/-小鼠與野生型小鼠的喚醒基線水平?jīng)]有明顯差異,但是在應(yīng)激后約兩周內(nèi)+/-小鼠喚醒水平持續(xù)處于較高狀態(tài)。這一結(jié)果提示,基因缺失導(dǎo)致的較低水平5-HT 可能參與創(chuàng)傷應(yīng)激后高喚醒狀態(tài)的保持,說明5-HT 可能具有促進(jìn)應(yīng)激反應(yīng)恢復(fù)的作用。有研究顯示,功能失調(diào)小鼠對社會挫敗應(yīng)激、束縛應(yīng)激、天敵應(yīng)激等急性應(yīng)激表現(xiàn)出更高的易感性(Brivio et al.,2018;Lieb et al.,2019;Russo et al.,2019;Sachs et al.,2015;Weidner et al.,2019),同時也有研究發(fā)現(xiàn)基因缺陷小鼠在多個焦慮行為測試中與野生型沒有顯著差異(Mosienko et al.,2014;Savelieva et al.,2008;Strekalova et al.,2021)。結(jié)合本研究中+/-小鼠在應(yīng)激后才出現(xiàn)喚醒水平持續(xù)上升的現(xiàn)象,我們推測基因缺陷引起的5-HT 低水平主要參與強應(yīng)激后相對緩慢的恢復(fù)過程,但是不影響較弱應(yīng)激刺激引起的即時反應(yīng)。Tph2 分布在中縫核的5-HT 神經(jīng)元內(nèi),是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)5-HT 合成過程中的重要催化酶,相關(guān)的基因缺陷會引起5-HT 合成的效率和總量降低(Abela et al.,2020;Gutknecht et al.,2012;Jacobsen et al.,2012;Liu et al.,2011)。通過光遺傳等技術(shù)對5-HT神經(jīng)元進(jìn)行調(diào)控的研究發(fā)現(xiàn),激活中縫核的5-HT神經(jīng)元會引起焦慮和恐懼行為增強,損毀神經(jīng)元或阻斷下游受體則降低焦慮(da Silva Soares et al.,2019),具體的神經(jīng)通路是中縫核到基底杏仁核或到背側(cè)海馬的5-HT 投射(Abela et al.,2020;Bernabe et al.,2020;Sengupta &Holmes,2019)。上述結(jié)果提示,短期內(nèi)5-HT 釋放增加具有增強焦慮、恐懼等應(yīng)激反應(yīng)的效果。但是,在我們的研究中,經(jīng)過基因敲除的小鼠Tph2 一直處于低水平,對5-HT 系統(tǒng)及其下游神經(jīng)結(jié)構(gòu)的功能有持續(xù)影響及代償效果,因此得到不同于光遺傳或藥理實驗中急性干預(yù)5-HT 系統(tǒng)的行為結(jié)果。對基因缺陷動物的研究發(fā)現(xiàn),5-HT 系統(tǒng)出現(xiàn) 5-HT 分解速度降低(Mosienko et al.,2014)、5-HT1A 受體功能和表達(dá)量改變(Gutknecht et al.,2012;Jacobsen et al.,2012)。因此,基因缺損引起的強應(yīng)激后持續(xù)高喚醒可能不僅與5-HT 合成降低有關(guān),還與5-HT 遞質(zhì)-受體系統(tǒng)的整體平衡失調(diào)有關(guān)。

本研究結(jié)果提示,雄性基因缺陷小鼠在強應(yīng)激后出現(xiàn)持續(xù)時間更長的高喚醒狀態(tài)。對應(yīng)激后高喚醒狀態(tài)與PTSD 其他癥狀發(fā)展的研究發(fā)現(xiàn),高喚醒能夠預(yù)測其他癥狀的發(fā)生或嚴(yán)重程度(Coronas et al.,2011;Greene et al.,2020;Shaikh al arab et al.,2012),高喚醒可能是驅(qū)動PTSD 病程發(fā)展的關(guān)鍵因素。另一方面,有研究發(fā)現(xiàn)基因的單核苷酸多態(tài)性與PTSD 和抑郁癥的癥狀發(fā)展、治療效果有關(guān)(Cao et al.,2014;Tao et al.,2018;Xu et al.,2016)。基于本研究結(jié)果,我們認(rèn)為基因缺陷可能通過加劇急性應(yīng)激后的高喚醒狀態(tài)增加PTSD 或抑郁癥的患病率,同時提示在創(chuàng)傷應(yīng)激后早期對5-HT系統(tǒng)的干預(yù)可能降低PTSD 的發(fā)生率。目前選擇性5-羥色胺重攝取抑制劑(selective serotonin re-uptake inhibitors,SSRIs)是治療PTSD 的主要臨床藥物,盡管治愈率僅為20%～30%,仍然高于其他類型藥物(Akiki &Abdallah,2018;Thakur et al.,2021)。目前對 SSRIs 用于創(chuàng)傷后早期干預(yù)的報道十分有限(Sijbrandij et al.,2015),創(chuàng)傷后使用SSRIs 能否降低PTSD 的發(fā)生率或嚴(yán)重程度仍需要更多臨床證據(jù)。我們的結(jié)果提示,在應(yīng)激后數(shù)日內(nèi)使用SSRIs,增加可用的5-HT,可能緩解基因缺損造成的中樞神經(jīng)系統(tǒng)5-HT 不足的個體的高喚醒狀態(tài)。

本研究采用了天敵暴露和足底電擊兩種急性應(yīng)激方式誘發(fā)持續(xù)的高喚醒反應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),天敵應(yīng)激對雄性野生型和+/-小鼠的驚嚇反射反應(yīng)沒有造成持續(xù)影響,與控制組的差異只在應(yīng)激后24 小時達(dá)到統(tǒng)計顯著水平,而較強的足底電擊引起雄性+/-小鼠驚嚇反射持續(xù)處于較高水平。兩種應(yīng)激方式都是當(dāng)前動物模型中常見的誘發(fā)PTSD 樣行為的強刺激,均能引起多種PTSD 樣行為,且持續(xù)時間超過一個月(Cohen et al.,2011;Cohen &Zohar,2004;Smith et al.,2019;T?r?k et al.,2019)。兩種應(yīng)激方式相比,天敵應(yīng)激是純粹的心理應(yīng)激,而電擊應(yīng)激伴隨以痛覺為主的傷害性體驗,二者受到不同神經(jīng)環(huán)路的調(diào)節(jié),誘發(fā)的應(yīng)激反應(yīng)存在一些差異(Gross &Canteras,2012)。對創(chuàng)傷應(yīng)激后驚嚇反射變化的研究相對較少,其中Cohen 實驗室的結(jié)果顯示,天敵或天敵氣味暴露10 分鐘能夠引起應(yīng)激后一個月時出現(xiàn)驚嚇反射上升。但是,該反應(yīng)存在明顯的個體差異,在雄性大鼠中,驚嚇反射明顯上升的個體約占40%,而雌性大鼠的比例較低,只有約16% (Koresh et al.,2016)。也有研究發(fā)現(xiàn),天敵應(yīng)激和電擊應(yīng)激均對驚嚇反射幅值沒有明顯影響(Smith et al.,2019;Zoladz et al.,2019),甚至有降低驚嚇反射的效果(Gonzales et al.,2008)。我們的研究中,雄性小鼠在應(yīng)激后短期出現(xiàn)了明顯的驚嚇反射上升,而基因缺陷雄性小鼠在電擊應(yīng)激后出現(xiàn)了超過10 天的驚嚇反射上升現(xiàn)象。這種現(xiàn)象可能是由于我們選擇的小鼠具有更高的基因相似性,個體差異小于Cohen 實驗室采用的封閉群大鼠,并且基因缺損導(dǎo)致的5-HT 系統(tǒng)失衡增強了驚嚇反射上升的持續(xù)時間。

本研究對比了雄性和雌性野生型和+/-小鼠在創(chuàng)傷應(yīng)激后的驚嚇反射反應(yīng),發(fā)現(xiàn)雌性小鼠的驚嚇反射基線水平低于雄性小鼠,且在強應(yīng)激后早期沒有出現(xiàn)幅度變化,僅在應(yīng)激后10 天經(jīng)天敵應(yīng)激的雌性+/-小鼠發(fā)現(xiàn)了較弱的驚嚇反射上升現(xiàn)象。這一結(jié)果說明,應(yīng)激引起的驚嚇反射反應(yīng)性別差異明顯。對人的驚嚇反射研究沒有發(fā)現(xiàn)男性與女性基線反應(yīng)存在差異(Hubbard et al.,2011;Verona&Kilmer,2007),但是對雌性大鼠驚嚇反射的研究發(fā)現(xiàn),雌性動物的驚嚇反射幅度低于雄性(Voulo &Parsons,2017),我們的結(jié)果認(rèn)為小鼠也同樣有此現(xiàn)象。雌性動物驚嚇反射偏低可能與性激素的調(diào)節(jié)有關(guān),因為有研究顯示,卵巢切除的雌性動物驚嚇反射有所上升(Zoladz et al.,2019)。我們的結(jié)果還發(fā)現(xiàn),雌性小鼠在應(yīng)激后沒有出現(xiàn)雄性小鼠中發(fā)現(xiàn)的驚嚇反射急性上升現(xiàn)象,這同樣與以往研究報道的雌性大鼠應(yīng)激后的表現(xiàn)相似(Voulo &Parsons,2017,2019)。事實上,女性中PTSD患病率高于男性(Kessler et al.,1995;Kilpatrick et al.,2013),與睡眠相關(guān)的高喚醒癥狀比男性更嚴(yán)重(Kobayashi &Mellman,2012)。性別差異對驚嚇反射的影響及其機制可能不同于其他PTSD 癥狀,目前尚無相關(guān)研究證據(jù)。本研究結(jié)果顯示雌性基因缺陷小鼠在天敵應(yīng)激后10 天相比野生型小鼠有驚嚇反射幅度上升,但是相比同組動物應(yīng)激前的驚嚇反射水平并沒有明顯差異,與未經(jīng)歷應(yīng)激的控制組轉(zhuǎn)基因雌鼠相比亦無差異。這一結(jié)果可能提示,雌性動物腦內(nèi)較低水平的5-HT 可能引起應(yīng)激后慢性的喚醒增強。對5-HT 調(diào)節(jié)慢性應(yīng)激反應(yīng)中的性別差異的研究較少,僅有少量研究顯示,雌性基因缺陷小鼠在應(yīng)激后沒有明顯焦慮反應(yīng)(Auth et al.,2018),5-HT 轉(zhuǎn)運體相關(guān)基因缺陷的雌性小鼠在應(yīng)激后腦內(nèi)杏仁核區(qū)域腦血流無明顯變化,而雄性小鼠該腦區(qū)的腦血流受到相關(guān)基因的明顯調(diào)控(Kolter et al.,2021)。

綜上所述,本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),5HT 合成中關(guān)鍵催化酶基因缺陷的雄性小鼠在創(chuàng)傷應(yīng)激后高喚醒持續(xù)時間更長,體現(xiàn)了基因和環(huán)境共同影響PTSD 高喚醒癥狀的發(fā)生、發(fā)展,也驗證了5-HT 在高喚醒的產(chǎn)生發(fā)展中的關(guān)鍵作用,說明5-HT 不足會導(dǎo)致應(yīng)激后更高的喚醒水平,難以恢復(fù)。這一結(jié)果為進(jìn)一步研究PTSD 高喚醒癥狀以及其5-HT 機制提供了行為遺傳模型。