施浩然，包廣龍，令狐熙濤，吳洪瀚，趙澤駒，劉霄，付瑤，黃帥，瓦慶德

1.遵義醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院骨科，貴州 遵義 563000；2.遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院泌尿外科，貴州 遵義 563003；3.遵義醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院腫瘤科，貴州 遵義 563003；4.四川大學華西第二醫(yī)院康復醫(yī)學科，成都 610041；5.廣州醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院骨科，廣州 510260

前列腺癌（prostate cancer，PCa）骨轉(zhuǎn)移是PCa 患者的主要死因，目前PCa 骨轉(zhuǎn)移的治療措施包括手術(shù)、化療及放療等，其中化療是PCa 骨轉(zhuǎn)移的主要治療方法之一。但化療易導致胃腸道反應(yīng)、神經(jīng)病變等副作用，因此探索有效且毒副作用較小的PCa 骨轉(zhuǎn)移治療藥物具有重要臨床意義[1～3]。微 小RNA（microRNAs，miRNAs）是一類短鏈非編碼RNAs，通過與目的基因3'-UTR 區(qū)結(jié)合抑制目的基因的表達，在PCa 骨轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要調(diào)控作用[4,5]。本研究組前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-204-5p 通過調(diào)控PCa 細胞NF-κB 信號通路下游基因的活性，從而抑制PCa 細胞的遷移、侵襲與骨轉(zhuǎn)移，表明miR-204-5p 是臨床干預(yù)PCa 骨轉(zhuǎn)移的靶點之一[6]。冬凌草甲素（Oridonin，ORI）是一類分離自冬凌草的二萜類活性物質(zhì)，其可通過誘導腫瘤細胞凋亡和自噬、阻滯細胞周期及逆轉(zhuǎn)細胞耐藥等途徑抑制腫瘤生長[7]。但冬凌草甲素能否通過調(diào)控miR-204-5p 和NF-κB 信號通路抑制PCa 細胞的轉(zhuǎn)移尚不清楚。2020 年6 月至2021 年3 月，本研究探索了冬凌草甲素通過調(diào)控miR-204-5p 和NF-κB 信號通路影響PC-3 細胞的增殖、遷移及侵襲機制，為冬凌草甲素作為潛在抗PCa 骨轉(zhuǎn)移藥物提供實驗參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人前列腺癌細胞PC-3 細胞系購自ATCC（美國典型培養(yǎng)物保藏中心，美國），使用補充有10%胎牛血清、5%青霉素和鏈霉素的1640 培養(yǎng)基將細胞接種至75 cm2培養(yǎng)瓶，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞進行后續(xù)試驗。

1.1.2 主要試劑 冬凌草甲素（武漢慧誠益通生物公司），RPMI 1640 培養(yǎng)基、0.25% 胰蛋白酶-EDTA（Hyclone，美國），胎牛血清、青霉素/鏈霉素(Gibco，美國)，P65、P84、TRAF1、TAB3 和MAP3K3 抗 體（Cell Signaling Technology，美國），CCK-8 細胞活性檢測試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司），RNA 提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR 試劑盒（Takara，日本），BCA 蛋白濃度測定試劑盒、超敏ECL 化學發(fā)光試劑盒（碧云天生物科技公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞增殖能力測定 0.25%胰酶消化PC-3 細胞制備細胞懸液，以2×103個/孔密度接種至96 孔培養(yǎng)板中，每組設(shè)5 個重復。待細胞貼壁后加入0、0.1、1、5、10、15、20、30、40 μmol/L 的冬凌草甲素溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后各孔加入10 μL CCK8 試劑孵育2 h，然后用酶標儀檢測450 nm 波長處的吸光度值。

1.2.2 qRT-PCR 分析 分別用濃度為0、5、10、15、20、30、40 μmol/L 的冬凌草甲素溶液處理細胞24 h，RNA提取試劑盒提取總RNA，根據(jù)Takara 試劑盒將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后使用Qantifest SYBR green mix（Qiagen）擴增。以U6 或GAPDH 作為對照，基因的相對表達率使用2-ΔΔCt法計算。引物詳細序列如下：

1.2.3 細胞轉(zhuǎn)染 將細胞以1×103個/孔的密度接種至96 孔平板中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至40%，使用Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑將miR-204-5p模擬物轉(zhuǎn)染入PC-3 細胞。

1.2.4 Western blot 分析 將PC-3 細胞接種至100 cm2培養(yǎng)皿中，待細胞密度增殖至80%時加入0、10 μmol/L 的冬凌草甲素溶液，24 h 后利用RIPA 與PMSF 混合裂解液提取藥物處理后的細胞總蛋白，BCA 標準法進行蛋白定量。制備10%～12%的SDS-PAGE 凝膠進行電泳，PVDF 膜電轉(zhuǎn)2 h，2% BSA 封閉1 h 后加入一抗，4 ℃冰箱避光孵育。TBST 洗滌3 次后加入二抗孵育1 h，加入ECL 發(fā)光液，在成像系統(tǒng)中曝光條帶。

1.2.5 遷移和侵襲能力檢測 酶消化，離心后重懸細胞沉淀，調(diào)整細胞密度至1×106個/mL，將100 μL 重懸液加入Transwell 上室，下室加入800 μL 細胞培養(yǎng)基，然后繼續(xù)培養(yǎng)24 h。24 h 后取出小室，4%多聚甲醛固定30 min，洗滌后用濕棉簽小心去除上室面細胞，然后用0.1%結(jié)晶紫進行染色20 min，晾干后在倒置顯微鏡隨中機選取5 個高倍視野進行拍照和計數(shù)，計算平均值。檢測細胞遷移能力時未在上室添加Matrigel 基質(zhì)膠，而在檢測細胞侵襲能力時，需用Matrigel 基質(zhì)膠稀釋液（1：5）包被Transwell 上室面基底膜，其余實驗條件相同。

1.3 統(tǒng)計學方法

所有實驗均重復3 次以上，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示。用SPSS 18.0 進行分析，組間差異比較采用t檢驗，P＜0.05 代表差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 冬凌草甲素抑制PC-3 細胞增殖

采用CCK8 檢測不同濃度冬凌草甲素溶液對細胞增殖能力的影響，結(jié)果表明冬凌草甲素呈濃度依賴性抑制PC-3 細胞的增殖，差異較對照組具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其IC50值約為10 μmol/L（圖1A）。在此基礎(chǔ)上，用10 μmol/L 冬凌草甲素溶液處理PC-3 細胞0、1、2、3、4、5 d 后，用CCK8 法檢測細胞的增殖能力，結(jié)果表明冬凌草甲素呈時間依賴性抑制PC-3 細胞的活力，差異較對照組具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖1B）。

表1 qRT-PCR 引物序列Tab.1 Sequence of primers used for qRT-PCR

2.2 冬凌草甲素抑制PC-3 細胞遷移及侵襲

Transwell 遷移及侵襲實驗結(jié)果顯示，用0、5、10、20 μmol/L 冬凌草甲素溶液處理PC-3 細胞24 h 后，冬凌草甲素呈濃度依賴性抑制細胞遷移（圖2）及侵襲能力（圖3），與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.3 冬凌草甲素上調(diào)miR-204-5p 表達并抑制NF-κB信號通路

用不同濃度（0、5、10、15、20 μmol/L）的冬凌草甲素溶液處理PC-3 細胞24 h 后，qRT-PCR 實驗結(jié)果表明冬凌草甲素溶液以濃度依賴性上調(diào)miR-204-5p 的表達，并抑制NF-κB 信號通路分子TRAF1、TAB3、P65 和MAP3K3 的表達（圖4A～E），與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。WB 實驗結(jié)果表明，過表達miR-204-5p 和冬凌草甲素均可抑制PC-3 細胞表達TRAF1、TAB3、P65 和MAP3K3，二者對NF-κB 信號通路調(diào)控作用相同（圖4F）。

3 討論

化療是晚期PCa 骨轉(zhuǎn)移患者的主要治療方法之一，但傳統(tǒng)化療藥物存在毒副作用及耐藥等不足，因此亟需尋找有效且毒副作用較低的藥物[8～10]。多種天然藥用植物活性成分具有高效抗瘤和低毒性的優(yōu)勢，如雷公藤提取物南蛇藤素能抑制PC-3 細胞增殖、遷移、VEGF 分泌和體內(nèi)致瘤性[11]；槲皮素通過抑制細胞增殖和遷移、誘導細胞凋亡等抑制PC-3 細胞在體內(nèi)外的致瘤作用[12]。本研究探索冬凌草甲素對PC-3細胞的作用及機制，為冬凌草甲素作為潛在候選藥物治療PCa 骨轉(zhuǎn)移提供前期實驗參考。

3.1 冬凌草甲素抑制PC-3 細胞增殖、遷移及侵襲

冬凌草甲素是冬凌草的有效成分，研究表明其具有良好的抗瘤活性，Xia 等[13]發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素可通過誘導細胞凋亡和阻斷Notch 信號通路抑制乳腺癌細胞生長和轉(zhuǎn)移；Xu 等[14]發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素可通過阻斷FAK-ERK1/2 信號通路抑制肺癌細胞的遷移和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

本研究探索了冬凌草甲素在體外是否能抑制PC-3 細胞的增殖、遷移與侵襲。首先用不同濃度的冬凌草甲素溶液（0、0.1、1、5、10、15、20、30、40 μmol/L）處理PC-3 細胞，24 h 后用CCK8 檢測其對細胞增殖能力的影響，結(jié)果顯示與對照組相比，冬凌草甲素溶液呈濃度依賴性抑制PC-3 細胞的增殖，其半抑制率（IC50）為10 μmol/L。在此基礎(chǔ)上，用10 μmol/L 的冬凌草甲素溶液處理細胞1～5 d 后，CCK8 檢測結(jié)果顯示，與對照組相比冬凌草甲素溶液呈時間依賴性抑制PC-3 細胞的增殖。其次，用0、5、10、20 μmol/L 冬凌草甲素溶液處理PC-3 細胞24 h，然后通過Transwell檢測細胞遷移及侵襲能力的變化，結(jié)果表明冬凌草甲素溶液呈濃度梯度抑制PC-3 細胞的遷移及侵襲能力，在5、10、20 μmol/L 冬凌草甲素溶液作用下，遷移及侵襲的細胞數(shù)較對照組明顯減少。上述結(jié)果提示冬凌草甲素在體外能抑制PC-3 細胞的增殖、遷移和侵襲。

3.2 冬凌草甲素通過上調(diào)miR-204-5p 抑制NF-κB 信號通路參與調(diào)控PC-3 細胞的轉(zhuǎn)移

microRNAs 是一類廣泛分布于真核生物中的非編碼RNA，其通過結(jié)合靶基因的3′UTR 區(qū)域以介導基因降解或抑制其翻譯[15,16]。研究發(fā)現(xiàn)microRNAs 的異常表達與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可作為腫瘤診斷的標志物和治療靶點[17,18]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-204-5p 在PCa 患者骨轉(zhuǎn)移組織和血清樣本中表達下調(diào)，上調(diào)miR-204-5p 表達可以抑制PCa 細胞在體內(nèi)外的遷移、侵襲和骨轉(zhuǎn)移；同時發(fā)現(xiàn)miR-204-5p 通過靶向TRAF1、TAB3 和MAP3K3 抑制NF-κB 信號通路活性，從而抑制PCa 細胞的侵襲、遷移和骨轉(zhuǎn)移能力[6]。miR-204-5p 在PCa 骨轉(zhuǎn)移過程中具有重要的調(diào)控作用，但冬凌草甲素能否通過調(diào)控miR-204-5p 表達影響PCa 細胞的轉(zhuǎn)移能力尚不明確。因此本研究重點是探索冬凌草甲素抑制PC-3 細胞的增殖、遷移與侵襲是否與miR-204-5p 有關(guān)。首先用不同濃度（0、5、10、15、20 μmol/L）冬凌草甲素溶液處理PC-3 細胞24 h，然后用PCR 檢測miR-204-5p 的mRNA 表達，結(jié)果顯示，與對照組相比冬凌草甲素能上調(diào)PC-3 細胞中miR-204-5p的表達，在10 μmol/L時上調(diào)作用最明顯。

NF-κB 是腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[19,20]。Park 等[21]發(fā)現(xiàn)NF-κB 通過刺激集落刺激因子促進乳腺癌骨轉(zhuǎn)移，表明NF-κB 是乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的防治靶點之一。我們前期研究已發(fā)現(xiàn)NF-κB 信號通路與PCa 細胞的侵襲、遷移和骨轉(zhuǎn)移能力相關(guān)，在本研究中，PCR 結(jié)果表明不同濃度的冬凌草甲素溶液除能上調(diào)miR-204-5p 外，同時抑制NF-κB 信號通路下游基因P65、TRAF1、TAB3 和MAP3K3 的表達。此外，Western blot 結(jié)果表明，冬凌草甲素溶液處理組與過表達miR-204-5p 結(jié)果一致，PC-3 細胞中NF-κB 信號通路下游分子P65、TRAF1、TAB3 和MAP3K3 蛋白表達較對照組均明顯下調(diào)。因此推測冬凌草甲素可上調(diào)miR-204-5p 阻斷NF-κB 信號通路分子表達參與調(diào)控PC-3 細胞的轉(zhuǎn)移能力。

綜上所述，本研究表明冬凌草甲素在體外能抑制PC-3 細胞的增殖、遷移及侵襲，可能與上調(diào)miR-204-5p 表達并阻斷NF-κB 信號通路活性有關(guān)。本課題主要探索了冬凌草甲素在體外對PC-3 細胞的抗瘤作用，下一步將以動物模型驗證其在體內(nèi)的抗瘤作用，以期為冬凌草甲素作為潛在抗PCa 藥物提供前期實驗參考。