趙仁禮，賴國(guó)華，吳家昌，吳銘杰，莊偉達(dá)，歐陽(yáng)鈞，桑宏勛

1.南方醫(yī)科大學(xué)深圳醫(yī)院骨科，深圳 518100；2.南方醫(yī)科大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院，廣州 510630 3.南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室 廣東省醫(yī)學(xué)生物力學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510515

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是一種具有多向分化、組織修復(fù)、調(diào)節(jié)炎癥和免疫應(yīng)答以及神經(jīng)保護(hù)等多種生物學(xué)功能的細(xì)胞[1]。研究表明，BMSCs 可通過(guò)不同的機(jī)制發(fā)揮自身功能[2]。除了傳統(tǒng)的細(xì)胞間相互接觸[3]，分泌細(xì)胞因子[4]或者通過(guò)配體-受體相互作用發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能[5]以外，BMSCs亦可通過(guò)旁分泌有生物活性的外泌體（exosomes）的方式發(fā)揮相關(guān)病理生理學(xué)功能[6]。外泌體是直徑在40～150 nm 之間的微囊泡，能夠通過(guò)運(yùn)輸細(xì)胞內(nèi)活性分子來(lái)介導(dǎo)細(xì)胞間通訊[7]。與其他細(xì)胞間信號(hào)傳遞方式相比，外泌體具有傳輸距離長(zhǎng)，較穩(wěn)定等特點(diǎn)，同時(shí)作為BMSCs 發(fā)揮功能的一種新途徑，在相關(guān)研究領(lǐng)域擁有廣泛的應(yīng)用前景[8]。在目前的研究中，大鼠和小鼠作為最常使用的動(dòng)物研究模型，其BMSCs 的外泌體也在組織修復(fù)和免疫調(diào)節(jié)方面受到了廣泛關(guān)注[9]。而如何分離獲取高純度和高質(zhì)量的BMSCs 來(lái)源的外泌體成為后續(xù)研究的基礎(chǔ)和前提。本研究從小鼠及大鼠長(zhǎng)骨骨髓中分離培養(yǎng)BMSCs，并通過(guò)同種差異超速離心的方法分離細(xì)胞培養(yǎng)上清中的外泌體，旨在探究差異超速離心法對(duì)BMSCs 來(lái)源外泌體分離的可靠性和穩(wěn)定性，為進(jìn)一步研究BMSCs 外泌體的生物學(xué)功能及其臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供一種可靠的方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4～6 周清潔級(jí)C57 小鼠20 只，體重14～16 g，4～6 周清潔級(jí)SD 大鼠20 只，體重180～200 g，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理中心提供，動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK(粵）2016-0167。

1.1.2 主要試劑及儀器 α-MEM 培養(yǎng)基、南美胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗溶液、胰蛋白酶-EDTA、PBS溶液和β 液巰基乙醇均購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；谷氨酰胺溶液購(gòu)自美國(guó)Corning 公司；小鼠及大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨、成脂、成軟骨誘導(dǎo)分化試劑盒均購(gòu)自賽業(yè)生物。大鼠及小鼠流式抗體PE-CD29、PECD44、PE-CD90、PE-Sca-1、PE-CD11b、PE-CD45、PECD19 及染色緩沖液均購(gòu)自美國(guó)Biolegend 公司。BCA 試劑盒購(gòu)自弗德生物，Western Blot 一抗CD9、CD63、CD81 和TSG101 均購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司，HRP二抗購(gòu)自弗德生物。ECL 增強(qiáng)型發(fā)光液購(gòu)自達(dá)科為公司。實(shí)驗(yàn)涉及儀器包括：萊卡正置熒光顯微鏡（DM4B），F(xiàn)ortessa 流式細(xì)胞儀（BD Biosciences）美國(guó)Beckman 公司超速離心機(jī)（Optima XPN-100），透射電鏡（日本日立公司H7650）；納米顆粒跟蹤分析儀（英國(guó)馬爾文公司，NanoSight NS3000）；化學(xué)發(fā)光儀（Bio-Rad）

1.2 研究方法

1.2.1 大鼠及小鼠BMSCs 的分離和培養(yǎng) 頸椎脫臼處死老鼠，收集股骨和脛骨骨髓細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基（α-MEM 培養(yǎng)基、15% FBS、1%雙抗、2 mmol/L 谷氨酰胺、0.1 mmol/L β-巰基乙醇）將細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，48 h 后第一次換液，以后每隔2 d 換1 次完全培養(yǎng)基，至細(xì)胞生長(zhǎng)融合至90%時(shí)，按照1:2 的比例進(jìn)行傳代。

1.2.2 BMSCs 成骨分化及茜素紅染色 按照BMSCs成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，具體步驟如下：取培養(yǎng)第3～5 代小鼠BMSCs，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到60%～70%時(shí)，加入2 mL 成骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基，每隔3 d 更換新鮮誘導(dǎo)分LL 化培養(yǎng)基，誘導(dǎo)4周,用茜素紅染液對(duì)鈣結(jié)節(jié)進(jìn)行染色，用顯微鏡觀察成骨染色效果。

1.2.3 BMSCs 成脂肪分化及油紅O 染色 按照BMSCs 成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，具體步驟如下：取培養(yǎng)第3～5 代BMSCs，待細(xì)胞融合度達(dá)到100 %后加入成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基A 液誘導(dǎo)3 d，然后加入成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基B 液誘導(dǎo)24 h，A 液和B 液交替誘導(dǎo)5 次后（20 d），繼續(xù)用B 液維持培養(yǎng)5 d 直至脂滴變大變圓。加入油紅O 染料工作液對(duì)脂滴進(jìn)行染色，用顯微鏡觀察成脂染色效果。

1.2.4 BMSCs 成軟骨分化及阿利新藍(lán)染色 按照BMSCs 成軟骨導(dǎo)分化培養(yǎng)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，具體步驟如下：取培養(yǎng)第3～5 代小鼠BMSCs（5×106）轉(zhuǎn)移到15 mL 離心管中，細(xì)胞離心后加入成軟骨完全誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每隔3 d 更換新鮮培養(yǎng)基，誘導(dǎo)28 d 后，加入阿利辛藍(lán)染液，用顯微鏡觀察染色效果。

1.2.5 BMSCs 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 取培養(yǎng)第3～5 代BMSCs，消化后用染色緩沖液將細(xì)胞濃度調(diào)整至107個(gè)/ml，取100 μL 細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP 管中，在每個(gè)的EP 管中分別加入如下抗體：小鼠BMSCs:PECD29、PE-CD44、PE-Sca-1、PE-CD11b、PE-CD45、PECD19；大鼠BMSCs：PE-CD29、PE-CD90、PE-CD11b、PE-CD45 混勻后冰上避光孵育45 min，孵育完畢后，用4 ℃PBS 洗滌細(xì)胞250 g 離心5 min，重復(fù)一遍洗滌離心過(guò)程，用400 μL PBS 重懸細(xì)胞，將染色后的細(xì)胞樣品上機(jī)檢測(cè)。

1.2.6 BMSCs 外泌體的分離和純化 取培養(yǎng)第3～5代BMSCs 消化后進(jìn)行1:2 傳代，傳代后用去外泌體血清（純血清100000 g 離心過(guò)夜，棄去沉淀，收集上清）配制的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h 后收集細(xì)胞上清，利用差速離心的方法分離純化細(xì)胞上清中的外泌體，具體步驟如下（圖1）：將收集的上清300 g 離心5 min，收集上清棄去沉淀；將上清2000 g 離心10 min，收集上清棄去沉淀；接著將上清10 000 g 離心1 h，收集上清棄去沉淀；將收集的上清放入超速離心機(jī)，110 000 g 離心70 min，小心棄去上清，用無(wú)菌PBS 重懸離心管底部沉淀，將重懸液再次110 000 g 離心70 min，小心棄去上清，離心管底部得到的沉淀即為分離純化后的BMSCs 外泌體，用適量PBS 重懸底部外泌體，-80 ℃儲(chǔ)存，待后續(xù)檢測(cè)使用。

1.2.7 BMSCs 外泌體的形態(tài)學(xué)觀察及NTA 粒徑分析 取適量分離純化后的外泌體樣品，用1%戊二醛室溫固定5 min，取10 μL 滴加至碳覆膜銅網(wǎng)上，滴加時(shí)形成水滴樣，樣品吸附90 s，用濾紙吸去多余液體后晾干，每個(gè)銅網(wǎng)上滴加10 μL 醋酸鈾染色液，避光染色30 s，用濾紙吸去多余液體，晾干，于透射電鏡（TEM）下觀察外泌體樣品形態(tài)；取適量濃度外泌體樣品運(yùn)用納米顆粒示蹤技術(shù)（NTA）對(duì)其粒徑進(jìn)行分析。

1.2.8 Western Blot 檢測(cè)BMSCs 外泌體蛋白標(biāo)志物表達(dá)水平 配制10%分離膠和5%濃縮膠，300 V 恒壓30 min 分離蛋白樣品，接著400 mA 恒流30 min 將樣品轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶室溫?fù)u床封閉1 h，分別加入CD9、CD63、CD81 和TSG101 抗體4 ℃孵育過(guò)夜，TBST 洗膜3 次后加入對(duì)應(yīng)種屬的HRP 二抗室溫孵育1 h，TBST 洗膜3 次，ECL 試劑盒顯影后進(jìn)行掃描成像。

2 結(jié)果

2.1 小鼠和大鼠BMSCs 的培養(yǎng)和鑒定

從小鼠和大鼠的股骨和脛骨骨髓細(xì)胞中分離培養(yǎng)原代BMSCs，細(xì)胞均勻生長(zhǎng)，原代細(xì)胞培養(yǎng)至10 d后即可進(jìn)行傳代，待細(xì)胞培養(yǎng)至3～5 代時(shí)，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，可見(jiàn)細(xì)胞形態(tài)均一呈梭形（圖2 A、E），形態(tài)清楚。取兩種BMSCs 細(xì)胞分別進(jìn)行成骨、成脂、成軟骨誘導(dǎo)分化，誘導(dǎo)28 d 后，分別對(duì)誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行茜素紅、油紅O、阿利新藍(lán)染色。顯微鏡下觀察到成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后的BMSCs 經(jīng)茜素紅染色，培養(yǎng)皿底可見(jiàn)典型紅色礦化結(jié)節(jié)（圖2 B、F）；成脂誘導(dǎo)后的BMSCs 經(jīng)油紅O 染色，細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)圓形紅色脂滴（圖2 C、G）；BMSCs 成軟骨誘導(dǎo)后，石蠟切片經(jīng)阿利新藍(lán)染色可見(jiàn)軟骨組織中的內(nèi)酸性粘多糖被染成藍(lán)色（圖2 D、H）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，小鼠BMSCs 表達(dá)CD29、CD44 和Sca-1 與細(xì)胞干性相關(guān)表面分子，不表達(dá)CD11b、CD45 和CD19 與造血或免疫細(xì)胞相關(guān)表面分子（圖2I）。大鼠BMSCs 的流式結(jié)果顯示CD29、CD90 高表達(dá)，CD11b 和CD45 基本不表達(dá)（圖2J）。綜上所述，分離培養(yǎng)的大鼠及小鼠BMSCs 具備干細(xì)胞特有的多向分化潛能，同時(shí)表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志性表面抗原。

2.2 BMSCs 外泌體的分離和鑒定

通過(guò)差異超速離心法（圖1），從細(xì)胞培養(yǎng)上清中分離純化出BMSCs 來(lái)源的外泌體，并根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的檢測(cè)方法從不同維度對(duì)收集的外泌體樣品進(jìn)行檢測(cè)。透射電鏡是鑒定外泌體形態(tài)的金標(biāo)準(zhǔn)，電鏡下可觀察到，無(wú)論是大鼠或小鼠，通過(guò)差異超速離心法分離純化的外泌體均呈現(xiàn)典型的雙層膜的杯托結(jié)構(gòu)（圖3A、B）。Western Blot 結(jié)果顯示，與對(duì)應(yīng)的BMSCs 細(xì)胞蛋白想比，大鼠和小鼠來(lái)源外泌體都能富集表達(dá)表面特異性標(biāo)志蛋白CD63、CD9、CD81 以及外泌體體內(nèi)蛋白TSG101（圖3C），結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的外泌體生物學(xué)特性相符。此外，通過(guò)納米顆粒跟蹤分析儀可檢測(cè)出外泌體樣品的直徑分布范圍，結(jié)果可見(jiàn)分離純化后的兩種外泌體直徑多分布在50～150 nm 之間，且分布只有一個(gè)峰值(圖3D、E)，提示外泌體粒徑大小分布集中，且粒徑符合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。綜上所述，通過(guò)差異超速離心法分離純化的大鼠及小鼠外泌體都有典型的形態(tài)學(xué)特征且兩者之間并沒(méi)有形態(tài)學(xué)上的差異；同時(shí)，兩種外泌體的粒徑大小和特異性標(biāo)志蛋白的表達(dá)情況都與文獻(xiàn)報(bào)道相同，且兩者并無(wú)差異。

3 討論

外泌體是一種由晚期核內(nèi)體膜向內(nèi)凹陷而形成的囊泡結(jié)構(gòu)[7]，是細(xì)胞間信號(hào)傳遞的重要載體，其自身包含多種蛋白質(zhì)、RNA 等有生物學(xué)活性的物質(zhì)，可將體內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至特定受體細(xì)胞體，從而實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)距離細(xì)胞間信號(hào)傳遞，在免疫應(yīng)答[10]、炎癥反應(yīng)[11]以及腫瘤轉(zhuǎn)移[12]等許多病理生理學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。同時(shí)，外泌體所發(fā)揮的生理或病理功能與其母細(xì)胞具有高度相似性?；谶@個(gè)結(jié)論，BMSCs 來(lái)源的外泌體被認(rèn)為是BMSCs 發(fā)揮功能的潛在介質(zhì)。已有文獻(xiàn)報(bào)道，BMSCs 來(lái)源的外泌體有促進(jìn)成骨[13]，改善心肌缺血再灌注損傷[14]等作用。同時(shí)，外泌體相比于細(xì)胞而言具有易制備和儲(chǔ)存,其功能不會(huì)隨著時(shí)間的推移而減弱[1]等特點(diǎn)，在日后的臨床應(yīng)用和轉(zhuǎn)化中相對(duì)于BMSCs 本身而言更具有優(yōu)勢(shì)。

目前，大規(guī)模分離和純化細(xì)胞來(lái)源外泌體仍然存在一些問(wèn)題，如何高效、高純度地提取外泌體是外泌體研究方法學(xué)的基礎(chǔ)。除了差異超速離心之外，基于不同的原理和外泌體不同的理化性質(zhì)，例如：電荷中和沉淀、凝膠過(guò)濾、磁珠親和和純化等方法也逐漸被使用。但目前仍沒(méi)有一種方法被外泌體研究領(lǐng)域認(rèn)定為分離純化的金標(biāo)準(zhǔn)。而就目前的研究來(lái)看，雖然差異超速離心法比較繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，但因其易操作、高效經(jīng)濟(jì)、提取純度高以及生物活性好等優(yōu)點(diǎn)，目前仍然是從細(xì)胞培養(yǎng)上清中提取外泌體最常用的方法。

本研究從大鼠及小鼠骨髓細(xì)胞中培養(yǎng)原代BMSCs，對(duì)培養(yǎng)3～5 代BMSCs 進(jìn)行多方向誘導(dǎo)分化并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物，鑒定分離培養(yǎng)BMSCs 細(xì)胞性質(zhì)。接下來(lái)，通過(guò)差異超速離心的方法分離純化兩種BMSCs 來(lái)源的外泌體，并對(duì)所提取的外泌體進(jìn)行了形態(tài)、粒徑分析及蛋白標(biāo)志物的檢測(cè)。通過(guò)形態(tài)學(xué)和標(biāo)志物的檢測(cè)，分離出的外泌體與目前關(guān)于外泌體的定義以及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道相一致[7]。同時(shí)，兩種外泌體在形態(tài)學(xué)和蛋白標(biāo)志物表達(dá)方面并沒(méi)有差異，僅僅通過(guò)外泌體的定性檢測(cè)方法不能區(qū)分和確認(rèn)兩種外泌體?？赡苄枰ㄟ^(guò)檢測(cè)種屬特異性蛋白才能更清楚地進(jìn)行區(qū)分。

本研究旨在研究差異超速離心法對(duì)BMSCs 來(lái)源外泌體分離的可靠性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，無(wú)論是大鼠或小鼠來(lái)源的BMSCs，用差異超速離心法均能分離純化到純度較高，生物活性較好的外泌體。證明差異超速離心法是一種可靠的分離BMSCs 培養(yǎng)上清來(lái)源外泌體的方法。我們將繼續(xù)探索并優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)化的提取方法，為外泌體功能的相關(guān)研究奠定方法學(xué)基礎(chǔ)。