李琛，張英杰，孫洋，王洪新

1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，遼寧 錦州 121001；2.錦州醫(yī)科大學(xué)心腦血管藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 錦州 121001

在多種血管疾病中觀察到不同程度的血管炎癥和氧化應(yīng)激，包括動脈粥樣硬化，高血壓和血管老化[1～3]。通常，血管炎癥和氧化應(yīng)激與內(nèi)皮功能障礙和血管損傷密切相關(guān)。二者在心血管疾病中的作用已經(jīng)得到了廣泛的研究。炎癥是由血管損傷引起的一個(gè)有序過程，它能增強(qiáng)白細(xì)胞的粘附性和趨化性，最終引起原位激活。這一過程由細(xì)胞因子的局部分泌協(xié)調(diào)，這些細(xì)胞因子的表達(dá)是由血管損傷誘導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)引起的[4]。氧化應(yīng)激反映出氧化劑和抗氧化劑之間的不平衡，朝著有利于氧化劑的方向發(fā)展[5]。Toll 樣受體（TLRs）能夠識別病原體相關(guān)分子模式（PAMPs）的微生物結(jié)構(gòu)成分。在識別PAMPs 時(shí)，TLRs 觸發(fā)促炎介質(zhì)的產(chǎn)生[6]。TLRs 也參與了氧化應(yīng)激的發(fā)生[7]。

RA 作為維生素A 的活性衍生物,具有多種免疫調(diào)節(jié)作用，廣泛參與了各種生理進(jìn)程的調(diào)節(jié)[8]。同時(shí)，RA 具有多種生理功能，包括抗炎[9]和抗氧化[10]。大量研究表明，RA 具有抗炎和抗氧化的作用，但其具體作用機(jī)制尚不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討RA對血管炎癥和氧化應(yīng)激的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對象、實(shí)驗(yàn)藥品和試劑

健康雄性SD 大鼠40 只，5～6 周齡，體重(200±10)g，由錦州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物許可證號：SCXK(遼）2014-0004。

視黃酸（純度≥98%，美國Sigma 公司）；視黃酸（RA）乙酰膽堿（Ach）和脂多糖（LPS）（美國Sigma 公司）；TLR4 抑制劑（美國Abmole 公司）；p-eNOS、TLR4 和NF-κB p65 抗體（美國ABclonal 公司）；IL-18、IL-1β、TNF-α、IL-6 和GSH-px ELISA 試劑盒（上海Mlbio 生物科技有限公司）；一氧化氮測定試劑盒、總超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒和丙二醛（MDA）測定試劑盒（南京建成生物技術(shù)有限公司）；DHE 熒光探針（碧云天生物技術(shù)有限公司）；eNOS 和β-actin抗體（美國Proteintech 公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組及給藥 健康雄性SD 大鼠40 只，置于適宜的環(huán)境中[(25±2)℃，12 h 光暗循環(huán)]，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，將大鼠隨機(jī)分為5 組（n=8）：對照組、LPS 組、RA 3 mg/kg 組、RA 15 mg/kg 組和TLR4 抑制劑組（3 mg/kg）。大鼠經(jīng)RA 和TLR4 抑制劑連續(xù)灌胃治療2 周后，除空白組外，其余大鼠通過腹腔注射LPS (10 mg/kg)以建立急性血管炎癥模型。8 h 后收集血清與主動脈，用于血管張力、免疫組化、ELISA 和免疫印跡等實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 體內(nèi)離體血管環(huán)實(shí)驗(yàn) SD 大鼠經(jīng)20%烏拉坦麻醉后，取出胸主動脈，并置于冰冷的PSS 溶液中(mM):NaCl (130);KH2PO4(1.18);KCl (4.7);NaHCO3(14.9);CaCl2(1.16);EDTA(0.026);MgSO4·7H2O(1.17)，然后小心剔除血管表面的脂肪組織和結(jié)締組織。將長度為1～2 mm 的胸主動脈環(huán)懸掛于張力換能器上。在無任何外力的作用下，儀器張力調(diào)零。血管環(huán)在15 mN 的張力下穩(wěn)定1h。時(shí)間結(jié)束后，在浴槽中加入60 mmol/L KCl 誘發(fā)胸動脈環(huán)收縮，PSS 溶液清洗3次。然后10-6mmol/L 的PE 預(yù)收縮胸動脈環(huán)，待張力達(dá)到平衡穩(wěn)定時(shí)，累積添加梯度濃度的Ach (10-9～10-5mol/L)，觀察并記錄胸動脈環(huán)張力的變化情況。PE 誘發(fā)胸動脈環(huán)的最大血管收縮幅度與初始血管張力之間的差值，作為胸主動脈的最終收縮幅度，在加入梯度的Ach 后張力的變化幅度與最終加入相應(yīng)劑量Ach 的收縮幅度之比，反應(yīng)張力的變化。

1.2.3 ELISA 法 按照ELISA 試劑盒說明書，測定血清中IL-18、IL-1β、TNF-α、IL-6 和GSH-px 的水平。

1.2.4 免疫組化法 石蠟切片在60℃烘箱中放置60 min 后進(jìn)行脫蠟脫水。然后將處理完的切片置于含有抗原修復(fù)液的高壓鍋內(nèi)，121℃抗原修復(fù)3 min。切片冷卻至室溫后，PBS 清洗3 次，使用3% H2O2室溫孵育15 min。然后血清封閉10 min，滴加一抗NF-κB p65（1：100），在4℃中孵育過夜。PBS 清洗切片3 次，滴加二抗，室溫孵育30 min。PBS 清洗3 次，滴加有辣根過氧化物酶的切片，在37℃水浴鍋孵育30 min。DAB顯色，蘇木素5min。最后經(jīng)酒精脫水，二甲苯透明后，封片觀察。采用LEIKA 顯微鏡進(jìn)行拍攝，LAS V4.3軟件分析NF-κB p65的陽性率，核棕色即為陽性。

1.2.5 Western blotting 凍存的新鮮組織從冰箱中取出后，將剪碎的20 mg 組織置于100 μl 的裂解液（RIPA+1% PMSF）中裂解30 min。蛋白濃度通過BCA 法進(jìn)行蛋白定量。制備10%的分離膠和5%濃縮膠，在90V 的電壓下，運(yùn)行2 h。通過半干轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。5% BSA 常溫封閉2 h。PVDF膜在含有TLR4（1:1000）、eNOS（1:1000）、p-eNOS（1:1000）和β-actin（1:1000）一抗的孵育盒中4℃孵育過夜。TBST 清洗3 次，每次5 min。PVDF 膜在辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1：5000）溶液中，常溫孵育1.5 h，ECL 發(fā)光顯影。

1.2.6 DHE 熒光 將濃度為2 μmol/L DHE 熒光探針滴加在冰凍切片上，在37℃孵育15 min，DAPI 染色5 min。PBS 在暗處清洗3 次，每次5 min。然后在熒光顯微鏡下進(jìn)行拍攝。相對熒光強(qiáng)度通過Image J 軟件進(jìn)行分析。

1.2.7 NO、SOD 和MDA 的測定 大鼠血清中的NO、SOD 和MDA 分別通過硝酸還原酶法、WST-1 法和TBA 法進(jìn)行測定，具體操作方法按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS25.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)均以表示。多組間顯著性檢驗(yàn)采用單因素方差分析和LSD 法。P＜0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RA 對體內(nèi)血管舒張功能的影響

在本實(shí)驗(yàn)，與對照組相比，LPS 組血管舒張功能顯著的降低。經(jīng)RA 和TLR4 抑制劑治療后，LPS 組血管的舒張功能得到顯著的改善（見表1）。

表1 RA 對大鼠血管舒張功能的影響（,n=4,mN）Tab.1 Effects of RA on vasodilation function in rats (Mean±SD, n=4,mN)

表1 RA 對大鼠血管舒張功能的影響（,n=4,mN）Tab.1 Effects of RA on vasodilation function in rats (Mean±SD, n=4,mN)

與LPS 組比較*P＜0.05，**P＜0.01

2.2 RA對血管eNOS、p-eNOS和血清NO水平的影響

與對照組相比，LPS 組血管p-eNOS 的表達(dá)和NO水平顯著的降低，而經(jīng)過RA 和TLR4 抑制劑治療之后，p-eNOS的表達(dá)和NO水平顯著升高（見圖1、表2）。

表2 RA 對血管p-eNOS、eNOS 蛋白和NO 水平的影響（, n=3）Tab.2 Effects of RA on the levels of p-eNOS,eNOS protein and NO in blood vessels (Mean±SD, n=3)

表2 RA 對血管p-eNOS、eNOS 蛋白和NO 水平的影響（, n=3）Tab.2 Effects of RA on the levels of p-eNOS,eNOS protein and NO in blood vessels (Mean±SD, n=3)

與LPS 組比較*P＜0.05，**P＜0.01

2.3 RA 對血清IL-18、IL-1β、TNF-α 和IL-6 的影響

對照組大鼠經(jīng)LPS 處理后，LPS 組大鼠血清炎癥因子IL-18、IL-1β、TNF-α 和IL-6 顯著升高，而RA 組相關(guān)炎癥因子顯著的降低，并且呈濃度依賴性，其中RA 劑量為15 mg/kg 的治療效果最佳。同時(shí)，LPS 組經(jīng)過TLR4 抑制劑處理后，炎癥因子IL-18、IL-1β、TNF-α 和IL-6 也顯著的降低（見表3）。

表3 大鼠血清IL-18、IL-1β、TNF-α 和IL-6 含量的變化（, n=8）Tab.3 Changes of serum levels of IL-18,IL-1 β,TNF-α and IL-6 in rats (Mean±SD, n=8)

表3 大鼠血清IL-18、IL-1β、TNF-α 和IL-6 含量的變化（, n=8）Tab.3 Changes of serum levels of IL-18,IL-1 β,TNF-α and IL-6 in rats (Mean±SD, n=8)

與LPS 組比較*P＜0.05，**P＜0.01

2.4 RA 對氧化應(yīng)激指標(biāo)ROS、SOD、MAD 和GSH-px的影響

與對照組相比，LPS 組MDA 和ROS 顯著升高，而SOD 的生成和GSH-px 釋放量顯著降低。經(jīng)過RA和TLR4 抑制劑治療后，以上的變化得到逆轉(zhuǎn)（見圖2、表4）。

表4 RA 對ROS、SOD、MAD 和GSH-px 含量的影響（，n=6）Tab.4 Effects of RA on the contents of ROS,SOD,MAD and GSH-px (Mean±SD, n=6)

表4 RA 對ROS、SOD、MAD 和GSH-px 含量的影響（，n=6）Tab.4 Effects of RA on the contents of ROS,SOD,MAD and GSH-px (Mean±SD, n=6)

與LPS 組比較*P＜0.05，**P＜0.01

2.5 RA 對血管TLR4 和NF-κB p65 蛋白表達(dá)的影響

與對照組相比，LPS 糖組TLR4 蛋白表達(dá)和核NF-κB p65 陽性表達(dá)率顯著升高，而RA 組能顯著的降低TLR4 和核NF-κB p65 陽性表達(dá)率，且RA 的作用與TLR4 抑制劑相似（見圖3、表5）。

表5 RA 對血管TLR4 的表達(dá)和核NF-κB p65 陽性表達(dá)率的影響（, n=3）Tab.5 Effects of RA on TLR4 and NF-κB p65 expression rate(Mean±SD, n=3)

表5 RA 對血管TLR4 的表達(dá)和核NF-κB p65 陽性表達(dá)率的影響（, n=3）Tab.5 Effects of RA on TLR4 and NF-κB p65 expression rate(Mean±SD, n=3)

與LPS 組比較*P＜0.05，**P＜0.01

3 討論

氧化應(yīng)激和炎癥密切相關(guān)，氧化應(yīng)激可引起炎癥，而炎癥又影響氧化應(yīng)激。二者都可以導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙的細(xì)胞損傷。而內(nèi)皮功能障礙又促使炎性環(huán)境的形成[4]。內(nèi)皮功能障礙的特征在于血管收縮增加和對Ach 的反應(yīng)性降低。內(nèi)皮NO 是關(guān)鍵的血管擴(kuò)張劑之一，其生物利用度降低可導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙，而eNOS 控制著NO 的合成[11,12]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RA能夠改善LPS 誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮功能障礙，同時(shí)能夠增加NO 和p-eNOS 的表達(dá)。這表明RA 可能通過增加eNOS 磷酸化，促進(jìn)NO 的合成釋放，最終改善血管內(nèi)皮功能障礙。

血管炎癥和氧化應(yīng)激參與了內(nèi)皮功能障礙的發(fā)生[4]。炎癥是對機(jī)體損傷或感染的保護(hù)性反應(yīng)。這是一個(gè)復(fù)雜的過程，炎癥細(xì)胞首先識別受影響的組織，白細(xì)胞招募進(jìn)入組織，清除致病因子，修復(fù)損傷部位。炎癥需要細(xì)胞膜，細(xì)胞外基質(zhì)和促炎介質(zhì)之間的相互作用，而過度炎癥可導(dǎo)致慢性疾病的進(jìn)展，如動脈粥樣硬化[2]。氧化應(yīng)激和促炎過程通常被認(rèn)為是相互依賴的，許多研究表明氧化應(yīng)激是炎癥直接刺激的結(jié)果，反之亦然[13]。在氧化應(yīng)激中，通常產(chǎn)生過量的ROS，增加MDA，同時(shí)，抗氧化系統(tǒng)受損導(dǎo)致SOD和GSH 的降低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RA 能夠降低LPS 誘導(dǎo)升高的炎癥因子IL-18、IL-1β、TNF-α 和IL-6 的水平，同時(shí)也能夠降低ROS 和MDA，升高SOD 和GSHpx。這表明RA 具有抗炎和抗氧化的作用。

LPS 是革蘭氏陰性細(xì)菌的成分，可以激活TLR4的表達(dá)。TLR4 激活后，一些多分子復(fù)合物觸發(fā)信號級聯(lián)，導(dǎo)致NF-κB 和MAP 激酶的早期激活，并控制促炎細(xì)胞因子如TNF-α 和IL-6 的產(chǎn)生[6]。NF-κB 是炎癥和氧化應(yīng)激共同的轉(zhuǎn)錄因子，NF-κB 激活后，進(jìn)一步的促進(jìn)炎癥因子和促氧化基因的轉(zhuǎn)錄激活，最終導(dǎo)致血管功能降低[13]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RA 能夠降低LPS誘導(dǎo)升高的TLR4 和NF-κB p65 的表達(dá)。而在給予TLR4 抑制劑TAK-242 后，炎癥與氧化應(yīng)激顯著的降低，同時(shí)，血管內(nèi)皮功能障礙得到改善。

本研究結(jié)果表明，RA 對LPS 誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮功能障礙具有保護(hù)作用，同時(shí)RA 降低炎癥因子的表達(dá)并抑制氧化應(yīng)激的產(chǎn)生，其作用機(jī)制可能與抑制TLR4/NF-κB p65 信號通路有關(guān)。