趙婧，焦卓亞，王娟，劉璐

山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)教研室，山西 汾陽 032200

作為常見的職業(yè)病，矽肺是由于長期暴露在游離二氧化硅（SiO2）中引起肺組織出現(xiàn)彌漫性纖維化病變的全身性疾病。臨床尚缺乏針對該病的根治性治療手段。肺泡炎癥性應(yīng)激、彌漫性肺纖維化、矽結(jié)節(jié)的產(chǎn)生是矽肺的主要病理改變[1]。研究表明肺泡上皮細(xì)胞炎癥性應(yīng)激是矽肺病程中的重要節(jié)點，緩解或阻斷該進(jìn)程可阻滯病程；SiO2激活肺泡巨噬細(xì)胞（macrophage）是致使肺泡上皮細(xì)胞炎癥的“扳機”[2,3]。Zhang 等[4]指出，在正常生理狀態(tài)，巨噬細(xì)胞中的脂質(zhì)的攝入與代謝處于動態(tài)平衡，受粉塵中SiO2等的刺激其脂質(zhì)代謝進(jìn)程受阻，巨噬細(xì)胞中脂質(zhì)沉積，促進(jìn)細(xì)胞泡沫化，釋放多種炎性因子，加重肺組織損傷。Hou 等[5]報道肺泡上皮巨噬細(xì)胞過度載脂以致細(xì)胞泡沫化貫穿在整個矽肺纖維化的病理過程中。因此進(jìn)一步揭示巨噬細(xì)胞脂質(zhì)代謝的調(diào)控機制，有可能阻滯矽肺的病程發(fā)展甚至是逆轉(zhuǎn)。Hegde 等[6]指出許多生化信號分子如轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、結(jié)締組織生長因子（connnective tissue growth factor，CTGF）等參與肺泡的脂質(zhì)代謝過程。近來Toll 樣受體4（Toll like receptor4，TLR4）/核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路在矽肺肺間質(zhì)纖維化中的作用引起關(guān)注。大量的動物實驗證實巨噬細(xì)胞中TLR4/NF-κB 信號被激活后，促進(jìn)下游炎性介質(zhì)的釋放，加重炎性應(yīng)激以及引起更重的肺損傷[7]，但是TLR4/NF-κB 信號是否參與巨噬細(xì)胞脂質(zhì)代謝的調(diào)控，尚未有定論。本研究通過建立大鼠矽肺模型，分離并培養(yǎng)其肺泡巨噬細(xì)胞，研究TLR4/NF-κB信號對巨噬細(xì)胞脂質(zhì)代謝的調(diào)控，初步探討矽肺的病理機制，為臨床提供研究數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物、主要試劑和主要儀器

實驗動物：SPF 級SD 雄性大鼠36 只，7～8 周齡，體質(zhì)量（200±20）g，從中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所采購，動物使用許可證號：SCXK（京）2018-0039；本研究經(jīng)本院實驗動物管理倫理委員會審核批準(zhǔn)（IACUC 批準(zhǔn)號：2019-079）。

主要試劑：二氧化硅，純度99.99%，粒徑（2.25±2.08）μm（美國Sigma 公司）。TLR4、MyD88、NF-κB抗體（德國Rebstock 公司），兔抗大鼠磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（美國Santa 公司），免疫組化試劑盒（南京建成生物有限公司），蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosinstaining，HE）試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)公司），酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（美國Amresco 公司），油紅O 染色試劑盒（北京華夏遠(yuǎn)洋科技有限公司）。

主要儀器：LIOOS600T 生物顯微鏡（日本尼康公司），-80 ℃深冷冰箱（德國維根斯公司），Leica RM2135 組織切片機（德國Leica 公司），高速低溫離心機（北京六一儀器廠），實時定量PCR 儀（加拿大Delong America 公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠矽肺模型構(gòu)建和分組處理 所有SD 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，按隨機數(shù)字表法分為正常組（Normal）、模型組（Model）、抑制劑組（Inhibitor），每組12 只。矽肺模型大鼠采用如下方法制作[8]：將SiO2粉塵與生理鹽水制成懸浮液（SiO2濃度為100 mg/mL），使用前先用高壓鍋進(jìn)行滅菌。將大鼠麻醉后，模型組、抑制劑組大鼠一次性氣管內(nèi)緩慢滴注（速度過快會導(dǎo)致大鼠嗆咳，呼吸困難）1 mL SiO2懸浮液，滴注過程中留意大鼠粗大濕羅音，表明已經(jīng)滴注到氣管，輕撫大鼠雙肺，使藥液分散均勻，正常組大鼠一次性滴注等劑量生理鹽水。2 周后，從模型組挑選2 只大鼠處死，取出肺，肉眼可看到橢圓形灰白色，質(zhì)地較硬的白色小結(jié)節(jié)，視為造模成功。

2 周后開始給藥，抑制劑組大鼠每天耳緣靜脈注射TAK-242（TLR4/NF-κB 信號特異性抑制劑），劑量為0.5 mg/kg，每日1 次，正常組和Model 組每天定時耳緣靜脈注射等劑量的生理鹽水。

1.2.2 支氣管灌洗液標(biāo)本采集 4 周后，將大鼠誘導(dǎo)麻醉處死，無菌剝離氣管，左主支氣管處插管，以絲線結(jié)扎，以PBS 緩沖液反復(fù)沖洗左肺，收集支氣管灌洗液（bronchial lavage fluid，BALF），離心，留取上清，置入深冷冰箱中；打開大鼠胸腔，無菌操作臺上取出肺，肉眼觀察各組大鼠肺組織的解剖學(xué)變化，然后以液氮封存，置入深冷冰箱中，待測。

1.2.3 肺組織病理學(xué)改變 取出各組10%大鼠肺組織，采用10%甲醛固定24 h 切片，HE 染色，光鏡下觀察病理改變。

1.2.4 ELISA 測定大鼠BALF 中IL-6 和TNF-α 含量取出各組BALF，離心后留取上清，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒要求進(jìn)行，采用多功能酶標(biāo)儀檢測各組大鼠BALF 中IL-6 和TNF-α 的含量。

1.2.5 肺泡巨噬細(xì)胞的分離 使用雙層醫(yī)用滅菌紗布過濾BALF，重復(fù)操作5 次后，離心，收集沉淀，用無血清的培養(yǎng)液沖洗3 次，每次2 min，置于培養(yǎng)皿中，加入適量RPMI1640 培養(yǎng)液，置入37 ℃，5% CO2，飽和濕度條件下培養(yǎng)，棄去未貼壁生長的細(xì)胞，培養(yǎng)皿中貼壁生長的即為大鼠肺泡巨噬細(xì)胞。

1.2.6 油紅O 染色觀察大鼠肺泡巨噬細(xì)胞脂滴形成調(diào)整各組肺泡巨噬細(xì)胞濃度，以3×104個/孔接種于6孔培養(yǎng)板中，置入37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)24 h后，4%甲醛固定30 min，PBS 清洗2 次，每次5 min，進(jìn)行油紅O 染色，無菌水清洗后，顯微鏡下觀察細(xì)胞中脂滴的形成。

1.2.7 PCR 檢測肺泡巨噬細(xì)胞中各脂質(zhì)代謝基因表達(dá) 采用RT-PCR 檢測脂質(zhì)代謝相關(guān)基因脂肪酸合成的乙酰輔酶A 羧化酶（ACC）基因、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1（SREBP）基因、脂肪酸合成酶（FAS）基因的表達(dá)。步驟如下：調(diào)整各組肺泡巨噬細(xì)胞濃度，以5×104個/孔接種于96 孔培養(yǎng)板中，置入37℃，5% CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)24 h，常規(guī)提取各組細(xì)胞的總RNA，測定其純度和完整度[9,10]，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR 儀進(jìn)行擴增。以2?ΔΔCt表示基因的相對表達(dá)量。

1.2.8 Western blot 檢測肺泡巨噬細(xì)胞中TLR4、MyD88、NF-κB 表達(dá)水平 調(diào)整各組肺泡巨噬細(xì)胞濃度，以1×104/孔接種于24 孔板中，置入37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)24 h，常規(guī)提取目標(biāo)蛋白TLR4、MyD88、NF-κB，測定蛋白濃度，準(zhǔn)確量取50 μg，電泳將蛋白分離，轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉，以（1：500）比例稀釋，維持4 ℃過夜孵育，次日，加入辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的二抗（1：1500），經(jīng)顯色，曝光、顯影、定影后，以GAPDH 為內(nèi)參表示蛋白的表達(dá)水平。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS 16.0 軟件，作圖工具采用Graphpad5.01，組間比較采用t檢驗，P＜0.05 表示具有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肺組織損傷

HE 染色結(jié)果顯示，正常組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整，未見充血、擴張、出血以及纖維增生現(xiàn)象，肺泡腔結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁厚度均勻，無水腫、增寬、滲出等，肺部微血管未見異常；模型組大鼠肺泡腔內(nèi)大量炎性細(xì)胞填充，肺泡壁增厚明顯，正常肺泡結(jié)構(gòu)數(shù)量明顯減少，間質(zhì)充血明顯，可見較多的粉塵樣物質(zhì)，出現(xiàn)結(jié)節(jié)性的細(xì)胞顆粒，部分結(jié)節(jié)纖維化明顯，呈現(xiàn)片狀分布，肺部微血管壁明顯增厚；抑制劑組大鼠肺組織的病理損傷明顯緩解，稍見結(jié)節(jié)，正常肺泡結(jié)構(gòu)數(shù)量較模型組明顯增多，見圖1。

2.2 大鼠BALF 中IL-6 和TNF-α 含量

ELISA 結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組、抑制劑組大鼠BALF 中IL-6 和TNF-α 的水平明顯升高（P＜0.05），與模型組相比，抑制劑組大鼠BALF 中IL-6 和TNF-α 的水平明顯下降（P＜0.05），見圖2。

2.3 大鼠肺泡巨噬細(xì)胞的脂滴形成

油紅染色結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組、抑制劑組大鼠肺泡巨噬細(xì)胞油紅O 陽性細(xì)胞的比例明顯升高（P＜0.05），與模型組相比，抑制劑組大鼠肺泡巨噬細(xì)胞油紅O 陽性細(xì)胞的比例明顯降低（P＜0.05），見圖3。

2.4 大鼠肺泡巨噬細(xì)胞脂質(zhì)代謝基因的表達(dá)

PCR 結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組、抑制劑組大鼠肺泡巨噬細(xì)胞中ACC、SREBP、FAS 的表達(dá)明顯升高（P＜0.05），與模型組相比，抑制劑組大鼠肺泡巨噬細(xì)胞中ACC、SREBP、FAS 的表達(dá)明顯降低（P＜0.05），見圖4。

2.5 肺泡巨噬細(xì)胞中TLR4、MyD88、NF-κB 表達(dá)水平

Western blot 結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組、抑制劑組大鼠肺泡巨噬細(xì)胞中TLR4、MyD88、NF-κB 的表達(dá)明顯升高（P＜0.05），與模型組相比，抑制劑組大鼠肺泡巨噬細(xì)胞中TLR4、MyD88、NF-κB 的表達(dá)明顯降低（P＜0.05），見圖5。

3 討論

矽肺是主要由職業(yè)暴露、自身免疫降低引起的慢性炎癥性纖維化疾病，屬于一種職業(yè)病，在我國玻璃行業(yè)、水泥行業(yè)、礦山行業(yè)、石材加工以及陶瓷行業(yè)中的發(fā)病率逐年升高，致使從業(yè)人員出現(xiàn)慢性阻塞性肺病和肺結(jié)核等諸多疾病，危害健康，嚴(yán)重影響這些行業(yè)生產(chǎn)力的提高[11]。因SiO2誘發(fā)矽肺的機制尚未完全明確，目前的治療以免疫抑制以及給予糖皮質(zhì)激素為主，不能有效控制纖維化進(jìn)展[12]。因此深入研究矽肺機制，尋求其可靠的靶向位點，在臨床藥物的開發(fā)中具有重大意義。

機體肺組織對于粉塵顆粒（主要含SiO2）的清除主要是通過肺泡巨噬細(xì)胞穿過上皮細(xì)胞層易位實現(xiàn)的。因此肺泡上皮巨噬細(xì)胞的病變在矽肺機制中扮演著重要的作用。Du 等[13]研究顯示當(dāng)機體暴露于SiO2環(huán)境中，作為抵御外界刺激的第一道防線，肺泡巨噬細(xì)胞借助脂質(zhì)和蛋白質(zhì)分子間的相互作用將進(jìn)入組織的SiO2吞噬，但是無法將SiO2消化掉，而造成脂質(zhì)（多為膽固醇）多度負(fù)載。Fang 等[14]報道巨噬細(xì)胞膽固醇代謝紊亂，SREBP 表達(dá)升高，膽固醇合成驟增是巨噬細(xì)胞泡沫化的關(guān)鍵因素，而以脂滴形式存在的膽固醇刺激ACC 和FAS 的合成，致使巨噬細(xì)胞中脂質(zhì)攝入、酯化、排出紊亂，最終造成巨噬細(xì)胞的生物活性降低，崩解死亡。本研究構(gòu)建大鼠矽肺模型，提取、分離、培養(yǎng)肺泡中的巨噬細(xì)胞，結(jié)果顯示模型組大鼠的巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)沉積明顯增加，脂質(zhì)代謝因子基因的表達(dá)明顯升高，進(jìn)一步證實巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)代謝在矽肺中的作用。

研究顯示巨噬細(xì)胞受吞噬的SiO2的毒性作用，釋放大量的致炎性因子，并將炎性信號逐級放大，大量炎性細(xì)胞在肺組織中浸潤，釋放更多的炎癥介質(zhì)如IL-6 和TNF-α 等，引起炎性級聯(lián)反應(yīng)，肺組織微循環(huán)正常功能受阻，上皮細(xì)胞通透性改變，內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙明顯，致使患者肺損傷[15]。TLR4/NF-κB 信號是機體內(nèi)重要的炎癥介導(dǎo)通路。Liu 等[16]研究指出TLR4 主要在肺組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞以及氣道上皮細(xì)胞中表達(dá)，在各種肺損傷中發(fā)揮調(diào)控作用。TLR4 極易被炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-6 等激活，將胞外炎性信號遞至胞內(nèi)MyD88，募集轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，將炎性級聯(lián)放大，使NF-κB 發(fā)生核移位，啟動下游基因的轉(zhuǎn)錄，釋放炎性介質(zhì)和趨化因子，發(fā)揮炎性正反饋調(diào)節(jié)，促進(jìn)肺損傷的病理進(jìn)程[17]。本研究中注射TLR4/NF-κB 信號特異性抑制劑TAK-242，抑制劑組大鼠的肺組織病理損傷明顯減輕，BALF 中IL-6 和TNF-α 的含量明顯下降，肺組織中TLR4、NF-κB 的表達(dá)隨之下降，說明該組大鼠的炎性應(yīng)激明顯受限。對巨噬細(xì)胞的研究結(jié)果顯示，抑制劑組巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)沉積明顯降低，脂質(zhì)代謝基因的表達(dá)明顯下降，說明TLR4/NF-κB 信號參與巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)代謝的調(diào)控。

綜上所述，在SiO2所致大鼠矽肺模型中，TLR4/NF-κB 信號參與肺泡巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)代謝的調(diào)控，抑制該信號的表達(dá)，能明顯抑制矽肺的病理損傷。但是如何將這種抑制作用應(yīng)用到臨床矽肺的治療，尚需更為深入的探討。