呂小剛，劉 旭，陳 靜，陳建華，梁引庫(kù)，欒明寶

（1. 陜西理工大學(xué)，生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723000；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410205）

酸橙（Citrus aurantiumL.）為蕓香科柑橘屬植物，是中醫(yī)臨床常用的理氣藥，枳實(shí)、枳殼分別為酸橙的干燥幼果和未成熟果實(shí)，是其入藥部位，主產(chǎn)于四川、重慶、湖南、江西、福建等省。枳實(shí)為5—6 月收集的自落果實(shí)，枳殼為7 月果實(shí)尚綠采收的果皮。枳實(shí)、枳殼的活性成分基本一致，主要為黃酮類、生物堿類和揮發(fā)油類等，因采收期不同，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)有所差異而分開入藥[1-3]。枳實(shí)的主要特征成分為生物堿辛弗林，是衡量酸橙品質(zhì)的重要指標(biāo)之一[4]，具有增加熱量消耗、氧化脂肪、升壓強(qiáng)心等藥理作用[5]，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、飲料等保健品行業(yè)[6]。

目前，酸橙中辛弗林的定量分析主要以反相高效液相色譜（RP-HPLC）為主，為了延長(zhǎng)堿性較強(qiáng)的小分子化合物辛弗林在常規(guī)色譜柱上的保留時(shí)間，通常會(huì)添加有害離子以便試劑不被快速洗脫，但此操作會(huì)減少色譜柱的使用壽命，且復(fù)雜成分的梯度洗脫增加了分析時(shí)間[7-8]。而高效毛細(xì)管電泳（HPCE）具有樣品前處理簡(jiǎn)單、無(wú)需預(yù)富集、樣品和溶劑用量少、分析耗費(fèi)低、速度快、分離度高等優(yōu)點(diǎn)，相比于RPHPLC 更加適用于成分復(fù)雜的天然產(chǎn)物的測(cè)定[9]。

沅江市為湖南省酸橙傳統(tǒng)主產(chǎn)區(qū)，產(chǎn)量長(zhǎng)期處于全國(guó)首位[10]。由于采收期對(duì)酸橙藥材質(zhì)量有重要影響[11]，故采用HPCE 法測(cè)定沅江酸橙從幼果到未成熟果實(shí)的整個(gè)生長(zhǎng)周期的生物堿辛弗林含量動(dòng)態(tài)變化，以期為沅江市酸橙最佳采收期的確定、質(zhì)量評(píng)價(jià)與控制等提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

酸橙樣品采集于湖南益森沅江枳殼中藥研究所資源圃，選取21 株酸橙種質(zhì)，每株從不同方位采摘酸橙果實(shí)作為試驗(yàn)樣品，酸橙的花期為4—5 月，5 月掛果，11 月果熟，從2020 年5 月18 日—9 月5 日，每隔半個(gè)月采集1 批，共采集8 批酸橙樣品。試驗(yàn)前樣品需要進(jìn)行前處理，將酸橙果實(shí)切片，曬干或低溫干燥，粉碎機(jī)粉碎，備用。

主要試劑：氫氧化鈉、四硼酸鈉（分析純，湖南匯虹試劑有限公司），磷酸二氫鉀（分析純，廣東光華科技股份有限公司），甲醇（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），甲醇（色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司），辛弗林標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%，北京索萊寶科技有限公司）。

主要試驗(yàn)儀器：Agilent 7100 型高效毛細(xì)管電泳儀（配置DAD 檢測(cè)器、Agilent OpenLAB C.01 工作站），XMTD-7000 水浴鍋，AX124ZH/E 電子天平。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密稱取辛弗林標(biāo)準(zhǔn)品0.010 6 g，加入甲醇溶解并定容于10 mL 容量瓶，配制成1.06 mg/mL 辛弗林標(biāo)準(zhǔn)品溶液。取辛弗林標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在甲醇溶液中連續(xù)稀釋成不同濃度梯度，以標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 酸橙樣品溶液制備 精密稱取酸橙樣品粉末1.000 g，加入30 mL 無(wú)水甲醇，稱定重量，在70℃水浴中加熱回流提取2 h，放冷，再次稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，將提取液以3 000 r/min 離心10 min，取上清液過(guò)0.45 μm 濾膜，取濾液作為樣品溶液，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.3 電泳條件優(yōu)化 （1）檢測(cè)波長(zhǎng)：取辛弗林標(biāo)準(zhǔn)品溶液，通過(guò)DAD 二極管陣列檢測(cè)器全波長(zhǎng)（190～400 nm）掃描，得到最優(yōu)檢測(cè)波長(zhǎng)。（2）緩沖液：比較酸橙樣品在相同濃度的四硼酸鈉緩沖液、四硼酸鈉-磷酸二氫鉀緩沖液和四硼酸鈉-磷酸二氫鉀緩沖液-30%甲醇緩沖液中目標(biāo)物色譜峰的峰形和分離效果，再進(jìn)一步考察不同濃度（20、30、40、50、60 mmol/L）四硼酸鈉-磷酸二氫鉀緩沖體系對(duì)樣品目標(biāo)物峰形的影響。（3）分離電壓：試驗(yàn)分別考察10、15、20、25、30 kV 分離電壓對(duì)酸橙樣品辛弗林峰形和分離效果的影響。

1.2.4 方法學(xué)考察 （1）精密度試驗(yàn)：取1.2.1 中標(biāo)準(zhǔn)品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5 次，測(cè)定辛弗林峰面積，考察檢測(cè)方法的精密度。（2）重復(fù)性試驗(yàn)：精密稱取50號(hào)酸橙種質(zhì)樣品粉末1 g 共6 份，按1.2.2 制備樣品溶液，測(cè)定辛弗林峰面積，考察檢測(cè)方法的重復(fù)性。（3）穩(wěn)定性試驗(yàn)：取酸橙樣品溶液，在室溫下儲(chǔ)存，分別在0、1、2、4、6、8 h 進(jìn)樣測(cè)定其含量，考察檢測(cè)方法的穩(wěn)定性。（4）加標(biāo)回收率試驗(yàn)：精密稱取已知辛弗林含量的同批酸橙樣品5 份，每份0.5 g，精密加入15 mL 辛弗林標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按1.2.2 樣品溶液制備方法處理后進(jìn)行檢測(cè)，考察檢測(cè)方法的回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 電泳條件優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 通過(guò)DAD 二極管陣列檢測(cè)器全波長(zhǎng)（190～400 nm）掃描，紫外光譜圖見圖1，在223 nm 處，標(biāo)準(zhǔn)品辛弗林有最大吸收峰，且基線平穩(wěn)，無(wú)背景干擾，因此選取223 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1 辛弗林標(biāo)準(zhǔn)品溶液紫外光譜圖

2.1.2 緩沖液體系和濃度的選擇 如圖2 所示，磷酸二氫鉀試劑的加入可明顯改善辛弗林色譜峰峰形，峰形更加對(duì)稱、尖銳，峰高也有所增大，有機(jī)改性劑可以提高選擇性，增大分離度，改善峰形。因此，綜合選取四硼酸鈉-磷酸二氫鉀緩-甲醇緩沖體系進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。由圖3 可知，緩沖液濃度較低時(shí)，樣品目標(biāo)峰出峰時(shí)間短，但峰形較寬，分離度低，且有其他雜峰干擾；隨著緩沖液濃度增大，峰形對(duì)稱，分離度增大；但是濃度太高，會(huì)降低電滲流，導(dǎo)致樣品出峰時(shí)間延長(zhǎng)。綜合選擇60 mmol/L 四硼酸鈉-磷酸二氫鉀緩沖液進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。較高的緩沖液濃度能適當(dāng)延長(zhǎng)分析物出峰時(shí)間，可以增加分離度。加入30%濃度甲醇，可以增大分離度，改善樣品峰型，高于此濃度會(huì)增大出峰時(shí)間。綜合上述結(jié)果，最終選定60 mmol/L 四硼酸鈉-磷酸二氫鉀-30%甲醇作為緩沖液。

圖2 不同緩沖液條件下酸橙樣品色譜圖

圖3 不同緩沖液濃度的影響

2.1.3 分離電壓的選擇 分離電壓對(duì)分離度的影響較小，選擇電壓時(shí)，主要考察電壓對(duì)峰遷移時(shí)間、峰形、基線和電流穩(wěn)定性的影響。試驗(yàn)結(jié)果見圖4，基電壓過(guò)低會(huì)導(dǎo)致峰形展寬，峰遷移時(shí)間過(guò)長(zhǎng)；隨著電壓增大，峰遷移時(shí)間縮短，峰形更加尖銳、對(duì)稱。但電壓過(guò)大時(shí)會(huì)造成樣品峰高降低，峰面積減小，樣品分離度下降。這與電壓增大導(dǎo)致電流增大，產(chǎn)生大量焦耳熱等因素有關(guān)。綜合考慮后，將最佳檢測(cè)電壓定為15 kV。

圖4 不同分離電壓的影響

綜合以上結(jié)果，最終確定的電泳條件如下：色譜柱為未涂層標(biāo)準(zhǔn)熔融石英毛細(xì)管（64.5 cm×50 μm，有效長(zhǎng)度56 cm，安捷倫科技有限公司）；緩沖液為60 mmol/L 四硼酸鈉-磷酸二氫鉀-30%甲醇，pH值（8.3）未經(jīng)調(diào)整；運(yùn)行電壓15 kV；壓力進(jìn)樣50 mbar×5 s；柱溫25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)223 nm。每天檢測(cè)之前將毛細(xì)管分別用水、1 mol/L 氫氧化鈉、超純水、緩沖溶液各沖洗5、5、5、10 min，其中在氫氧化鈉沖洗后靜置5 min，每2 次運(yùn)行之間僅用緩沖溶液沖洗5 min，多次檢測(cè)之后，需更換緩沖液并重新平衡毛細(xì)管。在此優(yōu)化電泳條件下，辛弗林標(biāo)準(zhǔn)品與酸橙樣品的色譜圖見圖5。

圖5 辛弗林標(biāo)準(zhǔn)品、酸橙樣品色譜圖

2.2 線性關(guān)系考察

結(jié)果表明，在33～530 μg/mL 的濃度范圍內(nèi)辛弗林的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y= 410.87X-3.068 9，相關(guān)系數(shù)為R2=0.999 9，呈良好線性關(guān)系，表明該方法適用于酸橙辛弗林含量測(cè)定。

2.3 方法學(xué)考察

檢測(cè)條件的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為1.8%、1.7%、2.2%，均小于3.0%，表明優(yōu)化后的檢測(cè)方法有良好的精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性。樣品的加標(biāo)回收率為93%，RSD 為2.3%，表明回收率良好，方法的準(zhǔn)確度良好。

2.4 辛弗林含量測(cè)定結(jié)果分析

隨機(jī)選取5 個(gè)酸橙種質(zhì)，測(cè)定辛弗林含量，結(jié)果見表1。采收期對(duì)酸橙果實(shí)中辛弗林含量有顯著性影響（P＜0.05），應(yīng)該選擇科學(xué)的采摘期。隨著采收期的推遲，沅江酸橙的辛弗林含量變化總體呈下降趨勢(shì)，從8 月中旬開始，酸橙辛弗林含量無(wú)顯著性差異，趨于穩(wěn)定。根據(jù)中國(guó)藥典2015 版[3]規(guī)定，按干燥品計(jì)算，枳實(shí)的辛弗林含量不低于3 mg/g，表1 中結(jié)果表明6月中旬之前采集的果實(shí)辛弗林含量基本都符合藥典規(guī)定，因此沅江市的枳實(shí)采收時(shí)間可定于5 月至6 月中旬。枳殼的采摘應(yīng)該在7 月中旬到8 月中旬，既能保證藥效含量高，此時(shí)期果實(shí)的產(chǎn)量也高，采收時(shí)間太晚，會(huì)導(dǎo)致枳殼果實(shí)瓤增大，皮變薄，不僅藥效下降，也會(huì)影響后期售賣[11]。

表1 不同采收期酸橙辛弗林含量測(cè)定結(jié)果 （mg/g）

取5 月18 日采集的第一批21 株酸橙種質(zhì)進(jìn)行辛弗林含量測(cè)定，以其含量繪制酸橙樣本正態(tài)概率分布圖（見圖6），所有樣本基本分布在直線附近，表明酸橙樣品辛弗林含量分布具有正態(tài)性，樣品取樣具有代表性。從圖7 可以看出，21 株酸橙種質(zhì)辛弗林含量為7.64～9.96 mg/g，相同的產(chǎn)地和采收期，不同酸橙種質(zhì)之間辛弗林含量有顯著差異（P＜0.05），編號(hào)為9、21、50、65、77 的5 株酸橙種質(zhì)辛弗林含量最高，可 為高生物堿特性的酸橙品種選育提供種質(zhì)資源。

圖6 酸橙樣品正態(tài)概率

圖7 不同酸橙樣品的辛弗林含量比較

3 結(jié) 論

試驗(yàn)首先進(jìn)行了HPCE 電泳條件的優(yōu)化，在優(yōu)化后的電泳條件下，酸橙樣品溶液無(wú)需進(jìn)行預(yù)富集，可在10 min 內(nèi)快速出峰，峰形較好，無(wú)拖尾，與相鄰組分分離度滿足分離要求，無(wú)其他物質(zhì)雜峰干擾。通過(guò)方法學(xué)考察，該測(cè)定方法可以在較寬的濃度范圍內(nèi)對(duì)酸橙樣品成分進(jìn)行分析，為酸橙的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供更多檢測(cè)方法，相比于RP-HPLC 檢測(cè)簡(jiǎn)單快速，成本更低。采用優(yōu)化后的方法測(cè)定沅江酸橙種質(zhì)中辛弗林含量，結(jié)果表明采收期對(duì)辛弗林含量影響顯著，應(yīng)該選擇科學(xué)的采摘期，沅江市的枳實(shí)采收時(shí)間可定于5 月至6 月中旬，而枳殼的采摘應(yīng)該在7 月中旬到8 月中旬。21 株酸橙種質(zhì)的含量測(cè)定結(jié)果表明，相同采收期酸橙辛弗林含量有顯著差異，編號(hào)為9、21、50、65、77 的5 株酸橙種質(zhì)辛弗林含量最高，可為高生物堿特性的酸橙品種選育提供優(yōu)異的種質(zhì)資源。