曾旭梅，席婉，朱琳琳，袁金梅，熊康舜，王彩云，鄭日如

園藝植物生物學教育部重點實驗室/華中農業(yè)大學園藝林學學院，武漢 430070

類胡蘿卜素是自然界中廣泛分布的一類次生代謝物，在植物的生長發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用［1］。同時，在植物花瓣、果實和葉片等器官中由于類胡蘿卜素種類及含量的差異，導致色澤的多樣性［2-5］，形成五彩繽紛的世界（圖1）。此外，類胡蘿卜素可裂解產生紫羅酮等重要香氣物質［6］。對植物而言，鮮艷的顏色和芬芳的氣味可有效吸引昆蟲或其他動物為其傳粉，提高生殖成功率［7］。在植物光合機構中，類胡蘿卜素能輔助捕獲光能并傳遞給葉綠素進行光合作用；也能有效清除自由基，避免光氧化對植物造成的損傷［8］。另外，類胡蘿卜素的下游產物脫落酸（abscisic acid，ABA）和獨角金內酯（strigolactone）是植物抵御逆境、調控生長發(fā)育等重要的內源信號物質［9］。類胡蘿卜素也是一類具有抗氧化能力的高價值天然活性物質，是人體膳食營養(yǎng)的重要組成部分［10］。因此，類胡蘿卜素代謝途徑的分子機制一直是園藝植物研究的熱點。

圖1 含類胡蘿卜素的常見園藝植物［2-5］Fig.1 Common horticultural plants containing carotenoids

在園藝植物中，類胡蘿卜素的代謝通路已基本明晰。近年來，隨著組學技術的不斷發(fā)展以及與遺傳學的深度融合，越來越多類胡蘿卜素代謝途徑的關鍵基因及其重要變異被挖掘并加以驗證。這些研究表明，代謝途徑中結構基因編碼區(qū)和啟動子的變異會導致基因功能及轉錄水平的顯著變化，從而改變類胡蘿卜素的種類和含量。分子標記輔助育種是未來種業(yè)的發(fā)展方向，解析優(yōu)良性狀形成的分子機制是開展定向改良的核心科學問題，開發(fā)可用于早期選擇的分子標記是實現高效育種的關鍵技術手段。因此，本文總結了植物類胡蘿卜素代謝通路、基因變異研究策略、基因變異對類胡蘿卜素代謝的影響及轉錄調控的研究，以期加深對園藝植物類胡蘿卜素多樣性的生物學認識，同時為開發(fā)分子標記、提升育種效率提供理論依據。

1 園藝植物類胡蘿卜素的多樣性

類胡蘿卜素的種類異常豐富，迄今為止已在植物、動物和微生物中發(fā)現800余種。它是一類含有40個碳的類異戊烯聚合物，由8個異戊二烯單位首尾相連形成。類胡蘿卜素類物質主要分為兩大類，一是只含碳氫元素的胡蘿卜素類，包括番茄紅素、八氫番茄紅素、α- 胡蘿卜素、β-胡蘿卜素等物質；二是胡蘿卜素類的含氧衍生物（即葉黃素類），包括葉黃素、蝦青素、玉米黃質等［11］。類胡蘿卜素也因其分子結構中存在的共軛雙鍵而呈現不同的顏色［12］。園藝植物中常見的類胡蘿卜素有紅色的辣椒紅素、橙紅色的β-胡蘿卜素、粉色的番茄紅素、橙黃色的紫黃質、黃色的黃體素和玉米黃質等［2，13-15］。不同種類和含量的類胡蘿卜素積累可形成園藝植物中美麗多彩的色澤［3，16］。同時，在柑橘、辣椒、西瓜、番茄等同種植物的不同品種間也可因類胡蘿卜素種類的不同而呈現色澤的差異（表1）。如柑橘中的‘溫州蜜柑’果實積累β-隱黃質而呈橙紅色，‘紅夏橙’果實積累紫黃質而呈黃色［35］；辣椒中紅色果實主要積累辣椒紅素，橙色果實主要積累辣椒紅素、玉米黃質，黃色果實主要積累葉黃素和β-胡蘿卜素［20-21］。此外，同一種植物也可積累不同含量的類胡蘿卜素而顯示色澤多樣性。如桂花中α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素含量的高低是區(qū)分丹桂（橙紅色）、金桂（橙黃色）、銀桂（黃白色）的關鍵因素［26，36］。因此，類胡蘿卜素的種類和含量是決定園藝植物色澤多樣性的重要原因。

表1 園藝植物中的主要類胡蘿卜素組分Table 1 Important carotenoids in different horticultural plants

2 植物類胡蘿卜素的主要代謝通路

植物類胡蘿卜素的代謝途徑已被闡述清楚，主要包括合成及降解兩個部分［37］。類胡蘿卜素合成始于異戊二烯焦磷酸（IPP）與二甲基丙烯焦磷酸（DMAPP）的縮合，在牻牛兒牻牛兒基焦磷酸合酶（GGPPS）的作用下生成的前體物質——牻牛兒牻牛兒基焦磷酸（geranylgeranyl pyrophosphate，GGPP）。兩分子的GGPP 通過八氫番茄紅素合成酶（phytoene synthase，PSY）的作用產生無色的八氫番茄紅素（phytoene），然后，在八氫番茄紅素脫氫酶（phytoene desaturase，PDS）、δ-胡蘿卜素異構酶（zeta-carotene isomerase，ZISO）、ζ-胡蘿卜素脫氫酶（zeta-carotenedesaturase，ZDS）和胡蘿卜素異構酶（carotenoid isomerase，CRTISO）等一系列酶的作用下生成番茄紅素（lycopene）。隨后，類胡蘿卜素代謝途徑被分為2 個分支點，由番茄紅素ε-環(huán)化酶（lycopene epsilon cyclase，LCYe）和番茄紅素β-環(huán)化酶（lycopene beta cyclase，LCYb）的環(huán)化分別產生α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素兩個重要產物［38］。α-胡蘿卜素在β-胡蘿卜素羥化酶（β-carotene hydroxylase，BCH）和ε-胡蘿卜素羥化酶（ECH）作用下生成葉黃素；而β-胡蘿卜素在β-胡蘿卜素羥化酶（BCH）、玉米黃質環(huán)氧化酶（zeaxanthin epoxidase，ZEP）、紫黃質脫環(huán)氧化酶（violaxanthin deepoxidase，VDE）、新黃質合成酶（neoxanthin synthase，NXS）等作用下，生成β-隱黃質、玉米黃質、新黃質等，其中新黃質是脫落酸（abscisic acid，ABA）的合成前體物質，也是β分支的最后一個產物。

植物類胡蘿卜素的降解由酶促反應和非酶促反應完成，可生成多種脫輔基類胡蘿卜素，如香氣物質、激素、色素及信號分子等［9，39］。其中，酶促降解過程在植物中主要由類胡蘿卜素裂解氧化酶（carotenoid cleavage oxygenases，CCOs）催化完成；非酶促降解過程通常與逆境脅迫應答相關。CCOs 可以特異性剪切C40類胡蘿卜素多烯鏈的共軛雙鍵，形成多種脫輔基類胡蘿卜素，部分產物還可進一步裂解［12］。CCOs 家族具有雙加氧酶特性，根據酶所裂解的底物是否發(fā)生環(huán)氧化，可將其分為類胡蘿卜素裂解雙加氧酶（carotenoid cleavage dioxygenases，CCDs）和 9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶（9-cis-epoxycarotenoid dioxygenases，NCEDs）［40］。在類胡蘿卜素降解過程中，CCD1 和CCD4 在植物的色澤和香氣物質代謝中發(fā)揮重要作用［6］。桂花、擬南芥、月季、矮牽牛等植物中，CCD1 和 CCD4 以 C40類胡蘿卜素和 C27脫輔基類胡蘿卜素為底物分解產生香葉基丙酮、β-紫羅蘭酮、假紫羅酮、α-紫羅酮等 C13或 C14香氣物質［41-46］。同時，類胡蘿卜素被CCD4 所裂解產生胭脂素、β-檸烏素及β-citraurinene 等天然色素物質，使紅木、柑橘等植物的種子或果實呈現誘人的紅色［15，47-50］。此

外，植物激素ABA 和獨角金內酯也是類胡蘿卜素裂解的重要產物［9］。番茄、水稻、鱷梨、葡萄及草莓等植物中NCED基因參與到ABA 生物合成過程，導致果實內源ABA 含量變化，果實表皮呈現不同色澤［51-56］。

3 植物類胡蘿卜素遺傳變異的常用研究方法

為了揭示色澤的遺傳變異規(guī)律，利用正向遺傳學方法進行研究，一般采取以下3 種手段：其一是挖掘突變體材料，如在番茄［57-58］、桃［59］、白菜［60］等研究中通過比較野生型和突變型的差異鎖定了關鍵變異基因。其二是用2 種不同表型的植株進行雜交產生性狀分離，再結合組學等技術明確差異區(qū)域，篩選并驗證關鍵基因［15，61-62］。如在柑橘的研究中，利用紅橘（紅果皮）和枳（黃果皮）F1代雜交子代混池RNA-seq 測序產生的SNP 進行混合樣本分組分析（BSA，bulked segregant analysis），再結合分子標記進行精細定位，揭示出CCD4b對色澤變異起到關鍵作用［15］。在花椰菜的花色研究中，對白花和黃花雜交的F2分離群體進行了BSA 分析結合全基因組重測序，篩選到了關鍵變異基因CCD4［63］。其三是利用豐富的自然品種尋找普遍規(guī)律。如在菊花研究中發(fā)現CmCCD4a在黃色品種中無法表達，而在白色品種中大量表達，進一步通過RNAi 驗證了CmCCD4a對類胡蘿卜素降解起重要作用，是黃色和白色花瓣差異的關鍵［16］。在桃中也利用不同基因型種質資源篩選得到果肉色澤差異基因［59］。

4 類胡蘿卜素代謝途徑關鍵基因變異研究與應用

關鍵代謝通路基因的編碼區(qū)及啟動子變異是造成植物類胡蘿卜素種類和含量差異的重要原因（表 2）。在花椰菜［63］、胡蘿卜［72］及菊花［77］等植物中證實，重要基因編碼區(qū)的變異可使基因功能和基因表達量發(fā)生變化，從而導致表型差異。PSY 是類胡蘿卜素生物合成途徑的限速酶，研究顯示在木薯和辣椒中，PSY編碼區(qū)多個 SNPs 和 InDels 的變異，可影響類胡蘿卜素的合成，使其呈現豐富的色澤［71，73］。番木瓜中的紅色果肉是由番茄紅素環(huán)化酶基因LCYb2的編碼區(qū)突變引起番茄紅素大量積累而產生［68］。再如，桃子黃色與白色果實相比，CCD4編碼區(qū)發(fā)生了多處SNPs、轉座子及逆轉座子插入、氨基酸替代等變化，從而導致酶活性喪失，類胡蘿卜素積累［59，64-67］。油菜的黃色花瓣中，由于CCD4基因編碼區(qū)插入了一個CACTA 類型轉座子導致降解功能喪失，下游的紫黃質大量積累；而未發(fā)生轉座子插入的白色花瓣中類胡蘿卜素裂解產生大量香氣物質紫羅酮［60］。擬南芥種子、甘藍花瓣中CCD4編碼區(qū)的SNPs 變異導致其裂解功能下降，類胡蘿卜素含量升高［62，78］。

表2 植物類胡蘿卜素代謝關鍵基因啟動子和/或編碼區(qū)變異的遺傳學機制Table 2 Genetic mechanism of variation of promoter and/or coding regions of key genes of carotenoids metabolism in plants

除了編碼區(qū)之外，啟動子的變異則可直接影響基因的轉錄水平，從而改變類胡蘿卜素代謝。如柑橘中的CCD4b基因啟動子中增加了Harbinger 類型MITE 轉座子。經煙草雙熒光素酶和GUS 酶活性檢測表明，MITE 轉座子上的SNP2G（CAACTG）可增強啟動子活性，促進CCD4b大量表達形成紅皮柑橘中特有的紅色β-檸烏素［15］。除此之外，還有部分植物類胡蘿卜素代謝途徑關鍵基因的編碼區(qū)和啟動子同時發(fā)生了變異，如白菜的類胡蘿卜素異構酶基因CRTISO的編碼區(qū)突變導致功能喪失，同時啟動子的88 bp缺失導致調控它的轉錄因子及代謝通路其他基因表達均受影響，最終前番茄紅素（prolycopene）在突變體中大量積累［60］。擬南芥種子中的CCD4［78］、ZEP［79］的啟動子和編碼區(qū)變異影響了種子類胡蘿卜素的積累。玉米LCYe［75］的改變則直接影響了α-和β-分支的流向。大量研究表明，植物類胡蘿卜素的種類及含量與相關基因表達量密切相關［1，9，12］，而啟動子活性直接調控基因表達，因此啟動子變異是造成色澤差異的另一主因。

在深入解析類胡蘿卜素變異的分子機制基礎上，利用差異片段開發(fā)可用于早期選擇的分子標記能有效提升育種效率。如在白菜的研究中發(fā)現，CRTISO啟動子88 bp缺失可導致白色葉片突變?yōu)辄S色葉片，由此開發(fā)了InDel 共顯性分子標記Br-Pro-Indel，可有效鑒別葉色，縮短育種周期［60］。玉米中的類胡蘿卜素含量與LCYe緊密相關，它的編碼區(qū)變異可引起α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、β-隱黃質等重要類胡蘿卜素代謝變化。根據編碼區(qū)變異片段設計特異引物，對后代進行PCR 擴增可快速鑒定變異并推斷表型［75］。因此，對類胡蘿卜素代謝通路基因變異的解析不僅可以豐富色澤多樣性的生物學理論，還可有效設計用于定向改良的分子標記。

5 植物類胡蘿卜素代謝途徑中關鍵基因的轉錄調控

類胡蘿卜素代謝調控一直是園藝植物研究的熱點，而轉錄因子通過直接或間接調控植物類胡蘿卜素代謝途徑關鍵基因的表達量，影響類胡蘿卜素的含量。在柑橘中，CsMADS5 既可直接結合PSY、PDS、LCYB1的啟動子，從而激活其轉錄，也可與CsMADS6形成增強子復合物，協(xié)同促進類胡蘿卜素的積累，調控果實著色［80］；CsERF061 激活PSY1、PDS、CRTISO、LCYb1、BCH、ZEP、NCED3、CCD1和CCD4等9 個關鍵類胡蘿卜素途徑基因的啟動子，參與類胡蘿卜素代謝的多靶點調節(jié)［81］。在番茄果實中證實，SlBBX20 可通過直接結合PSY1啟動子中G-box 基序激活類胡蘿卜素生物合成關鍵酶基因的表達，從而導致類胡蘿卜素水平升高［82］；再如SlMYB72 與八氫番茄紅素合成酶、胡蘿卜素異構酶和番茄紅素β 環(huán)化酶基因結合，調控類胡蘿卜素含量，使番茄果實呈現不均勻著色［83］。同時，在獼猴桃［84］、番木瓜［85］等果實中，AdMYB7、CpMYB1/2分別調控類胡蘿卜素的合成，影響果實的風味與色澤。轉錄因子也調節(jié)類胡蘿卜素裂解酶基因，導致園藝植物色澤和香氣物質不同。桂花ERF61［86］和WRKY3［87］與OfCCD4啟動子上的作用元件結合促進類胡蘿卜素裂解雙加氧酶基因的表達，調節(jié)花瓣中揮發(fā)性香氣物質（如β-紫羅蘭酮）的合成，從而導致品種間色澤和香氣的差異。葡萄MADS4 轉錄因子負調控VvCCD4b的表達，影響其主要香氣成分（如β-大馬士酮、β-紫羅蘭酮及α-紫羅蘭酮等）［88］。此外，番茄果實成熟過程中，研究顯示RIN 也可激活與成熟相關的基因，間接促進類胡蘿卜素的積累［89］。因此，轉錄因子調控類胡蘿卜代謝通路的關鍵基因，對園藝植物色澤差異也具有重要作用。

6 展 望

園藝植物與人們生活密切相關，色澤改良一直是園藝植物的重要育種目標之一。在柑橘、桃、葡萄、番茄、油菜等園藝植物及作物中，學者們已經逐漸探明類胡蘿卜素代謝途徑關鍵基因變異的分子機制，并在此基礎上開發(fā)了一系列輔助育種分子標記。分子標記輔助育種可直接針對特定農藝性狀對大量雜交后代開展快速且精確的檢測，大幅提高育種效率，具有重要的產業(yè)價值。