徐文剛，劉立明，王九龍，于文松，張建柏，征矢野清，唐永政

( 1.煙臺大學 海洋學院，山東 煙臺 264005； 2.煙臺市海洋經(jīng)濟研究院，山東 煙臺 264003； 3.長崎大學 環(huán)中國東海環(huán)境資源研究所，日本 長崎 851-2213 )

魚類成長周期中，內(nèi)分泌系統(tǒng)中的腦—垂體—性腺軸(BPG軸)分泌的激素能夠調(diào)節(jié)其生長、發(fā)育、繁殖、新陳代謝和能量平衡[12]。研究表明，光質(zhì)能改變魚類晝夜節(jié)律，調(diào)節(jié)BPG軸中與生長相關(guān)激素的分泌而影響生長[12-13]。生長激素(GH)在腦垂體中合成，主要調(diào)節(jié)生長和新陳代謝，生長抑素前體-Ⅰ(PSS-Ⅰ)在腦中合成并能抑制生長激素的合成和分泌，神經(jīng)肽Y(NPY)則能刺激食欲并影響晝夜節(jié)律[12]。光質(zhì)通過調(diào)節(jié)魚類GH、PSS-Ⅰ和NPY基因的合成而影響其生長[14]。Shin等[15]報道，綠光和藍光比紅光更能有效促進克氏雙鋸魚(Amphiprionclarkii)中GH基因的合成而加速其生長。

光質(zhì)不僅能影響魚類的生長，也能通過調(diào)節(jié)BPG軸中與繁殖相關(guān)激素的合成而影響其繁殖。已有研究表明，光質(zhì)能調(diào)節(jié)河鱸(Percafluviatilis)[16]和星點東方鲀(Takifuguniphobles)[17]腦垂體中促性腺激素(GtHs)的分泌而影響其性成熟。GtHs基因中的β亞基單元有兩種類型：促卵泡激素(FSHβ)和黃體生成素(LHβ)，F(xiàn)SHβ和LHβ基因受到下丘腦中促性腺激素釋放激素(GnRH)的調(diào)節(jié)[12]。近年研究表明，腦中分泌的Kisspeptin激素處于上游調(diào)控階段，能夠調(diào)節(jié)GnRH和GtHs基因的合成和分泌。Kisspeptin基因中的Kiss1和Kiss2基因與其受體G蛋白偶聯(lián)受體54(GPR54)結(jié)合后直接刺激GnRH神經(jīng)元，從而促進GtHs基因的合成，其功能與魚類的BPG軸相對應[18-19]。Shin等[20-22]報道，光質(zhì)不僅能影響金魚(Carassiusauratus)繁殖系統(tǒng)中各激素的合成和分泌，也能影響紅鰭東方鲀(T.rubripes)的生長和星點東方鲀[17]的成熟。因此，筆者以日本海域較具代表性的赤點石斑魚為研究對象，探究不同光質(zhì)LED光源對其1齡個體生長和性腺發(fā)育的影響；同時也探究不同光質(zhì)對試驗魚腦和腦垂體中與生長相關(guān)的基因如GH、PSS-Ⅰ和NPY，以及與繁殖相關(guān)的基因如Kiss1、Kiss2、GPR54、sbGnRH、FSHβ和LHβ表達量的影響，以期為未來石斑魚工業(yè)化高效養(yǎng)殖、資源保護及人工繁殖方面提供基礎生物學資料和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和設計

取168尾1齡左右赤點石斑魚[體質(zhì)量(42.29±0.77) g，體長(15.6±0.07) cm]，其中8尾作為試驗開始前的對照樣本，余下160尾飼養(yǎng)在4個裝有開放式流水系統(tǒng)和曝氣裝置的500 L水槽中，每個水槽放置40尾試驗魚，待其適應水溫和攝食等條件后開始試驗，試驗時間為2018年7月24日至9月23日。各組試驗魚暴露在白光色溫3000 K、紅光590 nm、藍光480 nm、綠光520 nm 4種不同光質(zhì)LED光源下飼養(yǎng)2個月，并在四周覆蓋黑色塑料布以避免自然光干擾。每個水槽放置8個0.72 W的LED燈，固定在距水面22～25 cm處，光照度約580 lx，光照周期為12L∶12D。試驗期間水溫為22.3～28.8 ℃(圖1)，鹽度29～31，pH 7.9～8.3，溶解氧>5 mg/L，24 h增氧。試驗期間每日早晚各投喂1次，觀察試驗魚的攝食情況并記錄每日攝食量和水溫的變化，所用飼料為Ohitome EP2 (日清丸紅飼料，日本)。試驗期間無個體死亡。

圖1 7月24日至9月23日試驗期間海水水溫的變化

1.2 采樣方法

1.2.1 體長和體質(zhì)量的測定

試驗開始時、試驗1個月和2個月后，分別測量各水槽中每尾魚的體長和體質(zhì)量，并按下式計算肥滿度(CF)、體質(zhì)量增加率(wWGR，%)和特定生長率(RSG，%/d)：

CF=100m/L3

(1)

wWGR=(mt-m0)/m0×100%

(2)

RSG=(lnmt-lnm0)/t×100%

(3)

式中，L為體長，m為體質(zhì)量，mt為終末平均體質(zhì)量，m0為初始平均體質(zhì)量，t為飼育時間。

1.2.2 樣品的采集

試驗開始前對對照樣本中的8尾魚進行采樣，試驗結(jié)束時各光質(zhì)組再分別取8尾魚作為試驗樣本。使用2-苯氧乙醇將魚麻醉后，測量其體長和體質(zhì)量，然后取出性腺，稱量質(zhì)量后將其立即置于波恩試劑中，固定24 h后于70%乙醇中保存，用于組織學分析。隨后打開頭蓋骨，取腦和腦垂體。由于所采集的腦部樣品較大，將腦短暫保存于液氮后移至-80 ℃冰箱中長期保存，腦垂體置于RNAlater試劑(Ambion Inc.，Invitrogen Life Technologies，Japan)中4 ℃低溫保存，1周后廢棄RNAlater試劑，移至-80 ℃冰箱中長期保存，用于分子生物學試驗。

1.2.3 性腺的組織學觀察

組織學分析步驟參照文獻[23]的方法，對赤點石斑魚性腺進行常規(guī)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋和連續(xù)切片，厚度為5 μm。采用蘇木精—伊紅染色，中性樹膠封片，Olympus FX380型光學顯微鏡觀察并拍照，以個體中卵母細胞最發(fā)達階段為性腺發(fā)育階段。參照文獻[24-25]的方法對性腺發(fā)育進行分期。

1.2.4 總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

取凍存的赤點石斑魚腦和腦垂體，參照TRIzol試劑盒(Life Technologies Corp.，USA)說明書進行總RNA提取，經(jīng)1%瓊脂凝膠電泳檢測RNA完整度，用NanoDrop 2000分光光度計(Thermo Scientific Inc.，美國)檢測RNA濃度。根據(jù)Transcriptor first strand cDNA synthesis(Roche Diagnostic GmbH，Mannheim，德國)說明書操作，取1 μg腦及腦垂體總RNA為反轉(zhuǎn)錄模板合成第一鏈cDNA，用于PCR擴增試驗。

1.2.5 腦和腦垂體中各基因?qū)崟r熒光定量PCR的檢測

腦中PSS-Ⅰ、NPY、Kiss1、Kiss2、GPR54和sbGnRH基因以及腦垂體中GH、FSHβ和LHβ基因表達量的測定方法為根據(jù)基因庫中各基因序列用Primer 3 Plus軟件設計熒光定量引物，由Fasmac公司(Kanagawa，日本)合成，引物序列見表1。各基因的測定參照EvaGreen 2×qPCR MasterMix-Rox(Abm Inc.，加拿大)試劑盒上的說明書操作。PCR反應體系：cDNA模板2 μL，5 μL EvaGreen 2×qPCR MasterMix，上下游引物(10 pmol/μL)各0.3 μL，2.4 μL滅菌超純水，總計10 μL。在CFX96 TouchTMReal-Time系統(tǒng)上(BioRad，美國)進行PCR反應，條件為：95 ℃預變性 10 min；94 ℃變性 45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，40個循環(huán)；95 ℃ 5 s，65 ℃ 1 min熔解；最后50 ℃冷卻30 s。PCR反應后獲得熔解曲線，檢測數(shù)據(jù)用相對定量法進行統(tǒng)計分析，β-actin作為內(nèi)參基因。

表1 實時熒光定量PCR反應中引物序列

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。采用SPSS 22.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行比較分析。并用Kolmogorov-Smirnov法進行正態(tài)分布檢測，利用單因素方差分析，檢驗體長、體質(zhì)量、肥滿度以及各基因表達量的差異，運用Tukey′s HSD多重比較檢驗各組數(shù)據(jù)間的差異顯著性，P<0.05時認為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同光質(zhì)條件下赤點石斑魚生長指數(shù)的差異

試驗期間不同光質(zhì)條件下赤點石斑魚各生長指數(shù)的變化見表2。由表2可見，試驗1個月后白光組魚的體長顯著高于藍光和綠光組(P<0.05)，體質(zhì)量和肥滿度顯著高于其他光質(zhì)組(P<0.05)。試驗結(jié)束時，白光組魚的體長顯著高于藍光和綠光組(P<0.05)，體質(zhì)量顯著高于綠光組(P<0.05)，但肥滿度差異不顯著(P>0.05)。試驗結(jié)束時白光組魚的體質(zhì)量增加率高于其他光質(zhì)組。

表2 試驗期間不同光質(zhì)條件下赤點石斑魚各生長指數(shù)的變化

2.2 不同光質(zhì)條件下試驗魚性腺發(fā)育的變化

試驗開始時，試驗魚性腺發(fā)育處于染色質(zhì)核仁期卵母細胞階段(圖2a)。卵巢內(nèi)可見染色質(zhì)核仁期卵母細胞，其直徑略大于卵原細胞。卵母細胞核較大，占據(jù)卵母細胞大部分面積。試驗結(jié)束時，各光質(zhì)條件下試驗魚性腺發(fā)育均處于周邊核仁期卵母細胞階段(圖2b1～b4)。卵母細胞細胞質(zhì)體積增加且呈強烈嗜堿性；卵黃核出現(xiàn)且直徑增加，核內(nèi)有少量核仁分布。

圖2 試驗開始和結(jié)束時各光質(zhì)條件下赤點石斑魚的性腺發(fā)育

2.3 不同光質(zhì)條件下試驗魚腦和腦垂體中與生長和繁殖相關(guān)各基因表達量的變化

試驗魚腦和腦垂體中PSS-Ⅰ、NPY和GH與生長相關(guān)基因表達量的變化見圖3。試驗結(jié)束時白光組試驗魚腦中PSS-Ⅰ基因表達量顯著高于試驗開始時的表達量(P<0.05)；試驗結(jié)束時各光質(zhì)組NPY基因表達量均顯著高于試驗開始時的表達量(P<0.05)；GH基因表達量在試驗開始和結(jié)束時差異不顯著(P>0.05)。

圖3 試驗開始和結(jié)束時不同光質(zhì)條件下赤點石斑魚腦和腦垂體中PSS-Ⅰ(a)、NPY(b)和GH(c)基因表達量的差異

試驗魚腦和腦垂體中Kiss1、Kiss2、GPR54、sbGnRH、FSHβ和LHβ與繁殖相關(guān)基因表達量的變化見圖4。試驗結(jié)束時，各光質(zhì)條件下試驗魚腦中GPR54基因表達量均顯著高于試驗開始時的表達量(P<0.05)，白光和藍光組sbGnRH基因表達量顯著高于試驗開始時的表達量(P<0.05)，但各光質(zhì)條件下腦中Kiss1基因表達量在試驗開始和結(jié)束時差異不顯著(P>0.05)。試驗開始時，試驗魚腦中Kiss2基因表達量太低未檢測到，但試驗結(jié)束時各光質(zhì)條件下的表達量均有所增加。試驗開始和結(jié)束時，各光質(zhì)條件下試驗魚腦垂體中FSHβ和LHβ基因表達量差異不顯著(P>0.05)。

圖4 試驗開始和結(jié)束時不同光質(zhì)條件下赤點石斑魚腦和腦垂體中Kiss1(a)、Kiss2(b)、GPR54(c)、sbGnRH(d)、FSHβ(e)和LHβ(f)基因表達量的差異

3 討 論

3.1 光質(zhì)對試驗魚生長的影響

本試驗中，赤點石斑魚暴露在不同光質(zhì)下2個月后，其體長、體質(zhì)量和體質(zhì)量增加率順序為白光組>紅光組>藍光組>綠光組，其中白光組最高，綠光組最低。已有研究表明，水溫13.6～16.7 ℃時，赤點石斑魚暴露在藍光下10周后比其他光質(zhì)更能促進其體質(zhì)量的增加[26]。此外，褐石斑魚(E.bruneus)[27]暴露在綠光下生長率最高，而點帶石斑魚(E.coioides)[28]暴露在紅光下死亡率最低。這些研究結(jié)果表明，當石斑魚暴露在不同光質(zhì)下，由于水溫、環(huán)境和物種等因素的差異，光質(zhì)對其生長的影響也有所不同。除石斑魚外，光質(zhì)也能影響其他魚類的生長。研究表明，綠光有利于豹紋鰓棘鱸(Plectropomusleopardus)[13]的攝食、生長和存活，而黃光對紅鰭東方鲀仔稚魚[29]的生長和發(fā)育具有促進作用，紅光和綠光不適合其生存。Luchiari等[30]報道，紅光可能對尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)的生長有害；而Volpato等[31]的研究表明，紅光能刺激其進食，也有報道表明，藍光更能促進其體長和體質(zhì)量的增加[32]。以上的試驗結(jié)果表明，不同LED光質(zhì)能夠影響魚類的生長，同時，魚類的生長還受魚種、年齡、生理階段、飼養(yǎng)條件和溫度等條件差異的影響。

本試驗中，白光組幼魚肥滿度在第1個月顯著高于其他光質(zhì)組，但2個月后差異卻不顯著。試驗中第1個月的平均水溫為26.7 ℃，此水溫為赤點石斑魚的最適生長條件，而第2個月的平均水溫僅為23.4 ℃。已有研究表明，恒溫26 ℃條件有助于加速赤點石斑魚的生長[10]。對斑點叉尾(Ictaluruspunctatus)[33]和大口黑鱸(Micropterussalmoides)[34]的研究表明，在試驗條件下，高水溫能促進其生長。本試驗中可能由于較高的水溫和白光的綜合作用使白光組幼魚在第1個月獲得較高的肥滿度。

3.2 光質(zhì)對試驗魚腦和垂體中與生長相關(guān)基因表達量的影響

試驗結(jié)束時，各光質(zhì)條件下試驗魚腦中的NPY基因表達量均顯著高于試驗開始時，表明4種光質(zhì)均能有效促進赤點石斑魚的食物吸收、新陳代謝和能量平衡。本試驗中，雖然試驗魚暴露在白光下2個月后其體長和體質(zhì)量均顯著高于其他光質(zhì)條件下，但白光組的GH基因表達量與其他光質(zhì)條件下和試驗開始時均無顯著差異，而PSS-Ⅰ基因表達量卻顯著高于試驗開始時。研究表明，GH基因主要用于調(diào)節(jié)魚類的生長，而PSS-Ⅰ基因能夠抑制GH基因的分泌[35]。本試驗中，雖然白光組試驗魚腦中PSS-Ⅰ基因表達量顯著增加，但其可能對GH基因的分泌沒有很強的抑制作用，因此對試驗魚生長的抑制作用有限。已有研究表明，魚類的生長受到內(nèi)分泌因素如皮質(zhì)醇、甲狀腺激素以及與繁殖相關(guān)激素的綜合影響，導致生長激素復雜的調(diào)節(jié)機制[36]。因此，進一步的研究需明確GH和PSS-Ⅰ基因具體的調(diào)節(jié)機制。

3.3 光質(zhì)對試驗魚性腺發(fā)育以及腦和垂體中與繁殖相關(guān)基因表達量的影響

試驗結(jié)束時，各光質(zhì)條件下試驗魚性腺從染色質(zhì)核仁期卵母細胞發(fā)育至周邊核仁期卵母細胞，且各組試驗魚的GPR54基因表達量以及白光和藍光組sbGnRH基因表達量均顯著高于試驗開始時，而FSHβ和LHβ基因在試驗開始和結(jié)束時的表達量無顯著差異。研究表明，內(nèi)分泌系統(tǒng)中的Kiss、GnRH和GtHs基因在赤點石斑魚[10]、星點東方鲀[37]、歐洲舌齒鱸(Dicentrachuslabrax)[38-39]和海鱸(Moronesaxatilis)[40]成熟和繁殖過程中起重要作用。此外，在鮭魚[41]、星康吉鰻(Congermyriaster)[42]、鰻鱺(Anguillajaponica)[43]和歐洲舌齒鱸[44]中，F(xiàn)SHβ基因?qū)π韵僭缙诎l(fā)育如精子和卵子的生長具有重要影響，而LHβ基因主要調(diào)控性腺發(fā)育的成熟階段如排卵和排精等行為，表明FSHβ和LHβ基因與多數(shù)魚類的性腺發(fā)育密切相關(guān)，且主要作用于青春期和成熟期。Tanaka等[45]報道，在人工養(yǎng)殖條件下，赤點石斑魚在2齡進入青春期，3齡達到性成熟。而本試驗中的赤點石斑魚僅為1齡，性腺尚處于初級卵母細胞發(fā)育階段，兩者均遠離成熟期。因此，與BPG軸功能相對應的Kiss、GnRH和GtHs基因的角色和功能在此階段可能并不明顯，即使GPR54和sbGnRH基因表達量顯著增加，可能也無法有效地誘導FSHβ和LHβ基因的合成與分泌，導致FSHβ和LHβ基因表達量無顯著差異。類似結(jié)果也出現(xiàn)在對河鱸的研究中，當未成熟的雄性和雌性河鱸暴露在白光、紅光、綠光或藍光下10 d后，F(xiàn)SHβ和LHβ基因表達量無顯著差異，原因可能是魚的繁殖周期尚未開始[16]。然而，當金魚暴露在白光、紅光和綠光下4個月后，綠光下金魚腦和垂體中Kiss1、GPR54、GnRH、FSHβ和LHβ基因表達量卻顯著增加，其性腺也處于成熟卵母細胞發(fā)育階段，表明Kiss1、GPR54、GnRH、FSHβ和LHβ基因在其繁殖系統(tǒng)中起重要作用[20]。因此，進一步的研究需明確不同光質(zhì)LED光源對成熟期赤點石斑魚繁殖系統(tǒng)發(fā)育的影響。