姜潔明，沈旭芳，劉 鷹,4，張 琦，周慧婷，王 佳，閆紅偉，王辰奇，劉 奇

( 1.大連海洋大學(xué)，遼寧 大連 116023； 2.設(shè)施漁業(yè)教育部重點實驗室，遼寧 大連 116023； 3.遼寧師范大學(xué)，遼寧 大連 116029； 4.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室，山東 青島 266237 )

紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)，屬鲀形目、鲀科、東方鲀屬，是一種重要的海水經(jīng)濟魚類。主要分布于西北太平洋區(qū)，從日本、俄羅斯和韓國沿海至我國東海均有分布，其味道鮮美、營養(yǎng)豐富，深受人們青睞。在日本和韓國，河鲀消費市場廣闊，尤以紅鰭東方鲀的消費量最大[1]。自2016年起，我國有條件放開養(yǎng)殖紅鰭東方鲀和養(yǎng)殖暗紋東方鲀(T.obscurus)加工經(jīng)營，有力地促進了國內(nèi)河鲀產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[2]。

紅鰭東方鲀是雌雄異體魚類，雖然生長性能沒有明顯性別差異，但經(jīng)濟價值卻有很大差異。一般雄魚2年性成熟，雌魚需要3年。在繁殖季節(jié)，紅鰭東方鲀性腺質(zhì)量可占體質(zhì)量的20%～30%，其卵巢含有劇毒無法食用，但雄魚的精巢無毒，且非常美味，我國稱之為“西施乳”，日本稱為“白子”，市場售價高達1400元/kg。因此，開發(fā)全雄育種將促進國內(nèi)河鲀產(chǎn)業(yè)發(fā)展，并會帶來巨大的經(jīng)濟效益[3]。解析出紅鰭東方鲀的性別決定和分化的分子機制，將為全雄育種提供理論基礎(chǔ)。

紅鰭東方鲀具有XX/XY性別決定系統(tǒng)[4]，其全基因組序列早在2002年就已公布[5]。它被認為是重要模式生物，其遺傳性別可由抗繆勒氏激素受體Ⅱ型(amhr2)基因上的一個單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點判定[6]，可通過高分辨率熔解曲線分析(HRM)或直接測序法檢測該SNP位點，從而有效判別其性別[7]。前期研究發(fā)現(xiàn)，紅鰭東方鲀(孵化溫度14 ℃，逐漸升溫至24 ℃時)性腺一般在孵化后40 d逐漸出現(xiàn)卵巢腔，55～77 d出現(xiàn)輸精管[8-9]。但由于紅鰭東方鲀繁殖周期較長，且在發(fā)育早期，性腺微小難以分離，有關(guān)紅鰭東方鲀性別分化的分子機制研究依然較為匱乏。

前期已分離出紅鰭東方鲀未分化期(40 d)微小性腺組織，采用RNA-seq技術(shù)篩選出大量XX和XY個體差異表達基因。其中包括在其他魚類性別決定及分化過程中也具有重要作用的基因，如doublesex和mab-3相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1(dmrt1)、性腺體細胞衍生因子(gsdf)、細胞色素P450第19家族A亞家族多肽1a(cyp19a1a)和叉頭框蛋白L2(foxl2)基因等[10]。筆者擬在前期研究工作的基礎(chǔ)上，以不同發(fā)育時期的性腺作為試驗對象，查明上述基因的表達規(guī)律，以期為后續(xù)解析這些基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

紅鰭東方鲀魚卵購自大連某養(yǎng)殖廠，魚卵質(zhì)量150 g。

1.2 試驗方法

1.2.1 養(yǎng)殖與樣品采集

養(yǎng)殖試驗設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，分別將魚卵置于300 L圓形養(yǎng)殖桶中曝氣孵化。自孵化后第3天開始投喂輪蟲，第12天開始投喂輪蟲的同時添加鹵蟲(Artemia)，第23天開始同時投喂配合飼料(海童1號沉降型飼料，三通生物工程，濰坊)和生物餌料，且配合飼料的投喂比例逐漸增多，生物餌料的投喂比例逐漸減少，第35天至第80天，僅投喂配合飼料。試驗期間飽食投喂，日投喂2～4次。日換水2次，每次換水1/2，水中不斷充氣，光照周期為12L∶12D，水溫(19±1) ℃。

在孵化后40、60、80 d，從3個生物學(xué)重復(fù)中各取30尾幼魚做組織學(xué)切片，觀察其性腺發(fā)育情況。每個取樣點取60尾(20尾/桶)，經(jīng)麻醉，解剖出性腺。將每尾紅鰭東方鲀的性腺分別放入裝有100 μL RNAlater動物組織RNA穩(wěn)定保存液(Ambion，美國)的離心管中，立即保存在-80 ℃冰箱中，用于RNA提取。同時，將所采集性腺相對應(yīng)的每尾紅鰭東方鲀的肌肉組織保存于無水乙醇中，-20 ℃冰箱保存，用于性別鑒定。

1.2.2 性腺組織學(xué)切片

樣品經(jīng)過梯度乙醇脫水，二甲苯透明、石蠟包埋，之后連續(xù)切片(5 μm)，37 ℃烘片3 h后室溫下冷卻，然后用二甲苯脫蠟、復(fù)水，再經(jīng)蘇木精—伊紅染色，脫水，二甲苯透明并封片。使用顯微鏡(卡爾蔡司，德國)觀察性腺組織學(xué)結(jié)構(gòu)、拍照[11]。

1.2.3 性別鑒定和RNA提取

用蛋白酶K處理(55 ℃，2 h)紅鰭東方鲀肌肉組織后，用TIANamp海洋動物DNA試劑盒(天根，中國)提取基因組DNA。用瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量后，為確定amhr2基因第9外顯子上SNP的基因型，使用amhr2基因特異性引物SDexonF(5′-CAGATGCACACAAACCACCT-3′)和SDexonR(5′-TCCCAGTGTTGCGGTATGTA-3′)進行PCR擴增。擴增體系(共50 μL)：ddH2O 30.5 μL，10×PCR Buffer 5 μL，dNTP Mix(2.5 mmol/L)8 μL，上、下游引物(10 mol/L)各2 μL，Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.5 μL，模板DNA(10倍稀釋后使用)2 μL。PCR流程為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；最后在72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。瓊脂糖凝膠電泳檢測之后，測序PCR產(chǎn)物。根據(jù)測序結(jié)果進行性別鑒定(圖1)，如果amhr2基因的SNP位點是雜合型，則對應(yīng)個體為雄性；如果SNP位點是純合型，則對應(yīng)個體是雌性。將每個養(yǎng)殖桶性別相同的個體性腺組織混合后作為一個樣本，分別用于RNA提取，使用RNeasy Mini RNA試劑盒(QIAGEN，德國)提取性腺組織中的總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢驗其完整性，檢測其濃度。提取的RNA置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 雄性(a)和雌性(b)紅鰭東方鲀的amhr2質(zhì)譜圖區(qū)別

使用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)對3個取樣時期(3個生物學(xué)重復(fù))的2種遺傳性別的共18個樣品中的基因表達進行分析，分析的基因為文獻[10]中篩選的在雄性紅鰭東方鲀未分化性腺中2個雄性高表達的基因(gsdf、dmrt1)和2個雌性高表達的基因(cyp19a1a、foxl2)，以及DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(dnmt1)和amhr2基因。使用Primer Premier 5.0設(shè)計引物(表1)。用DNA酶Ⅰ預(yù)處理1 μg RNA(37 ℃，30 min)，然后采用1st Strand cDNA Synthesis 試劑盒，進行cDNA的合成。使用β-actin做內(nèi)參基因。使用Applied Biosystems 7900 HT Real-Time PCR System進行qRT-PCR。qRT-PCR反應(yīng)體系(10 μL)為：ddH2O 6.15 μL，10×Ex Taq PCR Buffer 1 μL，dNTP Mix (2.5 mmol/L) 0.8 μL，上、下游引物(10 mol/L)各0.5 μL，Ex Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)0.05 μL，模板cDNA 1 μL。具體步驟為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；最后在72 ℃延伸10 min[10,12]。繪制熔融曲線，保證每對引物都能擴增出單一的PCR產(chǎn)物。

表1 試驗用引物序列

1.2.5 統(tǒng)計分析

表達量的計算用2-ΔΔCt法處理。采用統(tǒng)計軟件IBM SPSS 19.0(IBM，美國)中的t檢驗分析XX和XY個體性腺之間的基因表達量的差異顯著性，使用Duncan′s多重檢驗法檢驗不同發(fā)育時期基因表達的顯著性差異，顯著性設(shè)定為P<0.05。

2 結(jié) 果

2.1 紅鰭東方鲀性腺組織學(xué)觀察

紅鰭東方鲀性腺的組織學(xué)切片見圖2。在孵化后40 d時，XX和XY個體未觀察到形態(tài)上的性別分化，所有幼魚均為未分化的性腺(表2)。孵化后60 d時，在觀察的30尾魚中，14尾雌性，16尾雄性，XX個體的卵巢腔開始形成，卵原細胞開始產(chǎn)生，XY個體的性腺為橢圓形或圓形，性腺中開始有大量精原細胞形成；孵化后80 d時，在觀察的30尾魚中，18尾雌性，12尾雄性，XX個體的卵巢內(nèi)能夠清楚地觀察到由卵巢生殖上皮向卵巢腔凸起形成的產(chǎn)卵板和完整的卵巢腔，在產(chǎn)卵板上有大量的卵原細胞和少量的卵母細胞，在XY個體的精巢中，能夠清楚地觀察到完整的精巢結(jié)構(gòu)，精巢由精小囊組成，內(nèi)含精母細胞或精原細胞(圖2)。

圖2 孵化后40、60、80 d紅鰭東方鲀性腺組織學(xué)觀察結(jié)果

表2 不同采樣時期紅鰭東方鲀幼魚性別比例

2.2 性別分化相關(guān)基因的表達量

采用qRT-PCR對XX和XY紅鰭東方鲀幼魚性腺中amhr2、dmrt1、gsdf、cyp19a1a、foxl2、dnmt1基因的表達模式進行分析，結(jié)果見圖3。孵化后40、60 d，amhr2基因在XX和XY個體性腺中的表達量差異不顯著(P>0.05)，孵化后80 d，amhr2基因的表達量顯著上升(P<0.05)，且XX個體顯著高于XY個體(P<0.05)(圖3a)。在孵化后40、60、80 d，XY個體性腺中dmrt1的表達量均顯著高于XX個體性腺中的表達量(P<0.05)，且自孵化后40 d開始顯著升高，在XX個體性腺中，dmrt1基因在孵化后80 d的表達量也顯著高于在孵化后40、60 d的表達量，而孵化后40 d與60 d的表達量差異不顯著(P>0.05)(圖3b)。孵化后40、60、80 d，gsdf基因在XY個體性腺中的表達量也均顯著高于在XX個體性腺中的表達量(P<0.05)，且自孵化后40 d開始，其在XY個體性腺中表達量顯著增加。自孵化后60 d開始，gsdf基因在XX個體性腺中表達量顯著上升(P<0.05)(圖3c)。孵化后40 d開始，cyp19a1a基因在XX個體性腺中的表達量均顯著高于在XY個體性腺中的表達量，但在XX個體性腺中，孵化后60 d的表達量顯著低于孵化后40、80 d的表達量(P<0.05)。在XY個體性腺中，cyp19a1a基因表達量從孵化后40 d開始逐漸上升，但在整個采樣期間差異不顯著(P>0.05)(圖3d)；foxl2基因的表達模式與cyp19a1a基因相同，整個采樣期間，在XX個體性腺中的表達量均顯著在高于XY個體性腺中的表達量(P<0.05)，且在XX個體性腺中，孵化后80 d的表達量顯著高于40、60 d的表達量；而在XY個體性腺中，foxl2基因在整個取樣時期的表達量差異不顯著(圖3e)。孵化后40、60 d，dnmt1基因在XX和XY個體性腺中的表達量差異不顯著(P>0.05)，但在孵化后80 d， XY個體性腺中的表達顯著高于XX個體性腺中的表達量(P<0.05)。同時，在XX個體性腺中，dnmt1基因在整個取樣期間的表達差異不顯著(P>0.05)(圖3f)。

圖3 孵化后40、60、80 d XX和XY紅鰭東方鲀性腺中amhr2(a)、dmrt1(b)、gsdf(c)、cyp19a1a(d)、foxl2(e)以及dnmt1(f)基因表達水平

3 討 論

在性別決定和分化這個復(fù)雜的過程中，一般認為，魚類未分化的性腺最初具有向精巢或卵巢發(fā)育的雙向潛能，當(dāng)性別決定的“總開關(guān)”通過性別決定基因起始后，一類保守的性別決定和分化的遺傳網(wǎng)絡(luò)隨之激活，這類下游性別相關(guān)基因能調(diào)控性類固醇激素的表達，從而控制著性腺發(fā)育最終分化為一個有功能的性腺并與性別表型相對應(yīng)[13]。

3.1 性別決定位點所在基因amhr2基因表達

哺乳動物中有繆勒管結(jié)構(gòu)，其形成是由于雙潛能性腺分化為精巢之后，精巢支持細胞會產(chǎn)生抗繆勒氏激素(amh)抑制繆勒管的形成，抗繆勒氏激素主要通過amhr2在哺乳動物和其他脊椎動物生殖器官的發(fā)育和維持中發(fā)揮重要作用。魚類無繆勒管結(jié)構(gòu)，但是有的魚類性腺中仍然發(fā)現(xiàn)有amh和amhr2基因表達[14]。Hattori等[15]在研究銀漢魚(Odonthesteshatcheri)時發(fā)現(xiàn)，將Y染色體特異性基因(amhy基因)敲除，會使XY個體發(fā)生由雄性到雌性的性別逆轉(zhuǎn)，同時foxl2和cyp19a1a基因表達上調(diào)。使用CRISPR/Cas9基因敲除技術(shù)對尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)進行amhr2基因外顯子2和3進行突變，會導(dǎo)致由雄性到雌性的性別逆轉(zhuǎn)[16]。Morinaga等[17]對XX青鳉(Oryziaslaatipes)進行amhr2基因突變，在純合突變體中發(fā)現(xiàn)生殖細胞過度增殖導(dǎo)致腹部增大，因此卵巢增大。對成年魚的研究結(jié)果顯示，XX和XY突變體均不育，與野生對照型相比，壽命更短。通過對硬骨魚中amh和amhr2基因突變體的研究，發(fā)現(xiàn)amh通路在生殖細胞增殖中有重要作用。在硬骨魚類中，amh通路也控制性別，因此，amh在硬骨魚生殖細胞發(fā)育中的生物學(xué)功能可能先于繆勒管的形成[18]。Kamiya等[6]在對紅鰭東方鲀的研究中發(fā)現(xiàn)，amhr2基因中的一個錯義SNP位點突變可能是其主要性別決定的候選基因。在這個位點(G/C)上，雄性是雜合子，而雌性是純合子，在這個SNP位點上可以造成一個氨基酸的突變(His/Asp384)。前期結(jié)果表明，amhr2基因在2～10月齡雌雄紅鰭東方鲀性腺中均有表達，表達部位在生殖細胞周圍的體細胞中。筆者測定了紅鰭東方鲀性別分化期雌雄性腺中amhr2基因的表達量，結(jié)果顯示，amhr2基因的表達量在孵化后80 d顯著上調(diào)，且卵巢中的表達量顯著高于精巢中的表達量(P<0.05)，說明amhr2基因不但在精巢分化中起作用，在卵巢形成中可能也起到一定作用。已有研究表明，amh及其受體在魚類性別決定及分化過程中具有重要的作用[15-18]，檢測紅鰭東方鲀性腺分子分化關(guān)鍵期amhr2基因的表達，有助于闡明性別分化早期的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并為性腺功能相關(guān)基因的研究提供新的信息。后續(xù)還應(yīng)在紅鰭東方鲀研究中采用基因敲除技術(shù)對amhr2上性別連鎖的SNP位點進行突變，驗證其在這一物種的功能。

3.2 雄性性別分化相關(guān)基因表達

Dmrt1基因為動物界中參與雄性性別決定和精巢分化的保守基因[19]，它被證明是青鳉的性別決定因素[20]。在迄今研究的所有雌雄異體魚類中，dmrt1基因的表達模式總是與精巢發(fā)生和進一步分化密切相關(guān)，與性別決定系統(tǒng)無關(guān)[19]。Dmrt1基因總是在魚的精巢中高表達，在卵巢中低表達，青鳉中dmrt1基因的突變會誘導(dǎo)雌雄性別逆轉(zhuǎn)[21]。對斑馬魚(Daniorerio)進行dmrt1基因突變，結(jié)果表明，XY個體表現(xiàn)出精巢發(fā)育缺陷和生殖細胞凋亡[22]。本試驗結(jié)果表明，dmrt1基因在XY個體性腺中隨著性腺發(fā)育表達量急劇增加，在孵化后80 d時表達量最高，在XX個體中孵化后80 d的表達量顯著高于孵化后40、60 d，dmrt1基因在孵化后40、60、80 d XY個體中的表達量均顯著高于XX個體。因此，這一功能基因正如在其他物種中所報道的那樣，可能在紅鰭東方鲀的精巢分化以及雄性性腺發(fā)育中同樣發(fā)揮著重要作用。然而，本試驗結(jié)果與Yamaguchi等[9]的報道存在一定差異。Yamaguchi等[9]認為，dmrt1基因在性別分化期僅在支持細胞中有一定量表達，并不存在性別二態(tài)性，因此認為dmrt1基因不參與紅鰭東方鲀的精巢分化，而是在精子發(fā)生過程中僅僅參與精原細胞的增殖。原因可能是Yamaguchi[9]的研究僅依據(jù)逆轉(zhuǎn)錄PCR，而本試驗中采用實時熒光定量PCR技術(shù)開展分析，結(jié)果更準(zhǔn)確。

gsdf是一個僅在魚類中發(fā)現(xiàn)的新的轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)超家族成員，且是硬骨魚特有的性腺發(fā)育的功能基因。其首先在虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[23]中被發(fā)現(xiàn)，并被確定為虹鱒精子發(fā)生的關(guān)鍵基因。在青鳉中，Y染色體上的gsdf基因已被證實是性別決定基因[24]，青鳉中的gsdf-/-純合突變誘導(dǎo)XY個體性腺進行卵巢分化[25-26]。Jiang等[27]認為，在尼羅羅非魚中，gsdf基因是dmrt1基因的下游基因，gsdf基因可能通過抑制雌激素的產(chǎn)生誘導(dǎo)精巢分化。本試驗中，gsdf基因也與dmrt1基因一樣，在孵化后40、60、80 d XY個體中的表達量顯著高于XX個體(P<0.05)。推測gsdf基因在紅鰭東方鲀精巢分化中具有重要的作用，但其功能如何與其他性別分化相關(guān)基因(如dmrt1、cyp19a1a基因等)之間的上下游聯(lián)系仍需深入研究。

3.3 雌性性別分化相關(guān)基因表達

雌激素在魚類的性別分化中起著重要作用，由cyp19a1a基因編碼的芳香化酶通過催化雄激素轉(zhuǎn)化為17β-雌二醇(E2)，負責(zé)雌二醇的合成[28]。已有研究表明[10]，與類固醇生成途徑相關(guān)的性腺差異表達基因cyp19a1a在卵巢中高表達；筆者用實時熒光定量PCR進一步分析了此基因在孵化后40、60、80 d的紅鰭東方鲀性腺中的表達，結(jié)果顯示cyp19a1a基因在孵化后40、60、80 d的XX個體中表達水平均顯著高于在XY個體中的表達水平(P<0.05)；本試驗結(jié)果與在其他魚類中的結(jié)果類似，表明cyp19a1a基因在紅鰭東方鲀卵巢分化中具有重要作用且在魚類性腺分化中的功能具有保守性。對雌性斑馬魚進行cyp19a1a基因的敲除導(dǎo)致了全雄性表型[29]。Wu等[30]對斑馬魚進行dmrt1和cyp19a1a基因的雙突變，結(jié)果顯示，cyp19a1a基因通過抑制dmrt1基因的表達在決定卵巢分化中起作用。此外，編碼cyp19a1a激活轉(zhuǎn)錄因子的foxl2基因在雌性中的表達水平顯著高于雄性，這可能是cyp19a1a基因在雌性中表達水平高于雄性的原因之一[31]。本試驗中，XX個體性腺中foxl2基因的表達量在孵化后40、60、80 d均顯著高于XY個體(P<0.05)，推測foxl2基因可能通過調(diào)控cyp19a1a基因的表達進而影響其性別。在尼羅羅非魚中，foxl2-/-的XX個體表現(xiàn)出雌—雄逆轉(zhuǎn)，證明了foxl2基因在雌性分化中的作用[32]。在斑馬魚中，已分離到2個foxl2基因(foxl2a和foxl2b)，在foxl2a-/-和foxl2b-/-突變體中，卵巢的初始分化和卵母細胞發(fā)育都是正常的，而純合子foxl2a-/-/foxl2b-/-雙突變體在早期表現(xiàn)出完全的雌—雄性別逆轉(zhuǎn)[33]。在金錢魚(Scatophagusargus)中，只有一個foxl2基因存在，而且它是雌性偏向的，表明其在卵巢發(fā)育中也具有保守的功能[34]。綜上所述，foxl2基因在紅鰭東方鲀卵巢分化中可能有著十分重要的作用，但其功能和作用機制仍需進一步分析。

4 結(jié) 論

本試驗結(jié)果顯示，dmrt1、gsdf基因在紅鰭東方鲀幼魚XY個體性腺中顯著高表達(P<0.05)，而cyp19a1a、foxl2基因在XX個體性腺中顯著高表達(P<0.05)。筆者揭示的性別決定及分化關(guān)鍵作用基因的表達規(guī)律，可為后續(xù)解析這些基因的功能奠定重要基礎(chǔ)，也可為其他魚類繁殖生理學(xué)研究提供理論參考。此外，對相關(guān)基因的功能尚需進一步深入研究。