甘宜杰，張 偉,2,3，歐金梅,2，喬金為,4，金傳山

(1.安徽中醫(yī)藥大學藥學院，安徽 合肥 230012；2.新安醫(yī)學教育部重點實驗室，安徽 合肥 230038；3.中藥研究與開發(fā)安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230012；4.安徽中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230061)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種與衰老相關的神經(jīng)退行性疾病，其發(fā)病機制極其復雜，在疾病后期還會導致神經(jīng)細胞功能喪失和神經(jīng)細胞死亡，臨床表現(xiàn)為記憶損傷和行為失調(diào)[1]。目前臨床上用于治療AD的藥物只能在一定程度上改善或緩解AD患者的癥狀，但是未能緩解或阻止疾病的進程[2]。依據(jù)淀粉樣蛋白級聯(lián)假說，β淀粉樣蛋白(amyloid β，Aβ)是引起AD的主要原因，其在腦內(nèi)異常分泌和沉積毒害周圍的突觸和神經(jīng)細胞，最終造成神經(jīng)細胞損傷[3-4]。因此，抑制Aβ沉積是預防和治療AD的關鍵。

綠萼梅是薔薇科植物綠梅花ArmeniacamumeSieb. f.viridicalyx(MakinoT). Y. Chen的干燥花蕾，屬于理氣藥，性平，味微酸，歸肝、胃、肺經(jīng)，具有疏肝和中、化痰散結(jié)之功效[5]?！侗静菥V目》中記載梅花具有“助雅致，清神思”的功效，《本草原始》記載綠萼梅能夠安神定魂。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，綠萼梅對神經(jīng)系統(tǒng)具有保護作用[6]，提示綠萼梅對神經(jīng)退行性疾病具有預防和治療作用。人神經(jīng)母細胞瘤細胞(SH-SY5Y)分化程度較低，繁殖快,其細胞形態(tài)、生理及生化功能與正常神經(jīng)細胞類似，軸突明顯，是研究神經(jīng)系統(tǒng)疾病的常用模型[7]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，綠萼梅乙酸乙酯萃取部位分離得到的化合物對皮質(zhì)酮誘導的SH-SY5Y細胞有保護作用[8]。本研究對綠萼梅水提物經(jīng)大孔樹脂不同洗脫部位的抗Aβ活性進行篩選，同時結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜(ultraperformance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF/MS)定性分析抗Aβ活性部位的化學成分，為綠萼梅的進一步開發(fā)和利用提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 試劑 人神經(jīng)母細胞瘤細胞株(SH-SY5Y細胞)：美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC)；青霉素-鏈霉素(批號 71766505)：聯(lián)科生物技術股份有限公司；噻唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT；批號 0123A18)：北京雷根生物技術有限公司；胰蛋白酶(批號 112818181228)：上海碧云天生物技術有限公司；胎牛血清(fetal bovine saline,FBS)：Hyclone公司；Aβ1-42(批號 J10M9E60422)：上海源葉生物有限公司。

乙醇(化學純)：上海蘇懿化學試劑有限公司；AB-8大孔樹脂(批號 C12115168)：上海麥克林生化科技有限公司；綠原酸(批號 DST200520-021，純度≥98%)、蘆丁(批號 DSTDL001701，純度≥98%)、金絲桃苷(批號 DST200628-023，純度≥98%)、異槲皮苷(批號 DSTDY000601，純度≥98%)：成都樂美天醫(yī)藥科技有限公司；乙腈(質(zhì)譜級)、甲酸(質(zhì)譜級)、甲醇(質(zhì)譜級)：美國Fisher公司。

1.2 主要儀器 Xevo G2 QTOF質(zhì)譜儀、ACQUITY Ⅰ型超高效液相系統(tǒng)：美國Waters公司； 3K15型低溫高速離心機：Sigma公司；TCL-16G-A型高速冷凍離心機：上海安亭科學儀器廠；Forma 3111型水套式CO2培養(yǎng)箱：賽默飛世爾科技有限公司；SW-CJ-2FD型超凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；TriStar LB941微孔板式多功能酶標儀：德國Berthold公司；AB-135S型十萬分之一分析天平：德國梅特勒上海有限公司；Milli-Q型超純水儀：Millipore公司。

1.3 藥材 藥材于2019年2月購買于安徽省歙縣，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學中藥資源中心劉守金教授鑒定為薔薇科植物綠梅花ArmeniacamumeSieb. f.viridicalyx(MakinoT). Y. Chen的干燥花蕾。

2 方法

2.1 綠萼梅抗Aβ活性部位的篩選

2.1.1 樣品的提取與制備 取50 g綠萼梅藥材，按照12、8、6倍量加入蒸餾水加熱回流提取3次，每次1 h。合并濾液并濃縮至0.5 g/mL，流經(jīng)AB-8大孔樹脂，依次使用水、30%乙醇、60%乙醇、90%乙醇依次洗脫，減壓回收溶劑，分別得到水部位(ST-0)、30%乙醇洗脫部位(ST-30)、60%乙醇洗脫部位(ST-60)、90%乙醇洗脫部位(ST-90)。細胞實驗前，將各洗脫部位干浸膏用超純水超聲溶液，再用培養(yǎng)基稀釋至所需濃度，0.22 μm濾膜過濾除菌，4 ℃條件下保存。

2.1.2 試劑的配制 Aβ1-42溶于0.01 mol/L PBS緩沖液中，配制成1 mmol/L的母液，4 ℃保存。各綠萼梅洗脫部位分別溶于0.01 mol/L PBS緩沖液中，配制成1 mg/mL的母液，0.22 μm濾膜過濾除菌，4 ℃條件下保存。

2.1.3 細胞培養(yǎng)及分組 SH-SY5Y細胞采用含有10% FBS、青霉素(終濃度為100 μg/mL)、鏈霉素(終濃度為100 μg/mL)的DMEM/F12培養(yǎng)基，置于5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)，隔天換液。選取對數(shù)生長期細胞，以每孔5×103接種于96孔培養(yǎng)板中。將細胞分成空白對照組(使用無血清DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng))、模型組(含5 μmol/L Aβ1-42的無血清DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng))、綠萼梅各濃度不同洗脫部位組(含5 μmol/L Aβ1-42和1、10、100 μg/mL綠萼梅洗脫部位的無血清DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng))，繼續(xù)孵育48 h。

2.1.4 MTT測定細胞存活率 孵育結(jié)束前4 h，每孔加入20 μL MTT溶液(PBS稀釋配置5 mg/mL)。孵育結(jié)束后，棄去各孔上清液，每孔加入150 μL DMSO，細胞振蕩儀上振蕩10 min，待結(jié)晶物充分溶解后使用酶標儀在570 nm測定各孔吸光度值OD570。

2.2 UPLC-Q-TOF/MS鑒定活性部位成分

2.2.1 供試品溶液的制備 分別取ST-60及ST-90適量，精密稱定。置于5 mL容量瓶中，加入50%的甲醇定容至刻度，超聲溶解，制成每毫升含1 mg的樣品溶液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.2 色譜條件 色譜柱為Thermo Syncronis C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流速：0.2 mL/min；柱溫：30 ℃；流動相：乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)。洗脫梯度：0～6 min，6%→9% A；6～12 min，9%→13% A；12～16 min，13%→13% A；16～26 min，13%→30% A；26～36 min，30%→40% A；36～38 min，40%→6% A；38～43 min，6% A；進樣量2 μL。

2.2.3 質(zhì)譜條件 ESI離子源，正負離子模式，樣品錐電壓為40 V，源溫120 ℃，脫溶劑氣溫度450 ℃，脫溶劑氣體積流量為800 L/h。采用MSE采集方式，采集時間30.0 min，質(zhì)荷比(m/z)100～1 200，掃描間隔0.1 s。碰撞能量：碰撞低能量6 V，碰撞高能量為10～35 V。碰撞氣為高純He，霧化氣為高純N2。Lockmass采用亮氨酸-腦啡肽，m/z556.276 6(正離子模式)、554.2615(負離子模式)。數(shù)據(jù)采集由MassLynx V 4.1軟件控制。采用Waters UNIFI軟件分析其中各化學成分的保留時間及其質(zhì)譜信息，并結(jié)合其分子離子峰與對照品、文獻報道的數(shù)據(jù)進行對比，再對其中的化學成分進行辨識。

3 結(jié)果

3.1 活性部位篩選實驗 綠萼梅抗Aβ毒性作用部位篩選實驗結(jié)果見圖1，與空白對照組比較，模型組細胞存活率顯著下降(P<0.05)，說明Aβ誘導的SH-SY5Y細胞模型細胞存活率顯著降低。與模型組比較，綠萼梅各濃度不同洗脫部位組細胞存活率均顯著上升(P<0.05)，且高濃度不同洗脫部位組細胞存活率大于中、低濃度不同洗脫部位組，說明綠萼梅不同洗脫部位的藥效具有濃度依賴性；ST-60和ST-90提高細胞存活率的效果強于ST-0與ST-30。因此選擇ST-60和ST-90進行化學成分分析。

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.2 綠萼梅活性部位辨識 在中國知網(wǎng)、PubChem等數(shù)據(jù)庫中查詢并匯總綠萼梅(含梅花)的化學成分，建立包含化合物名稱、分子式、相對分子質(zhì)量等信息在內(nèi)的綠萼梅成分的一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫。根據(jù)綠萼梅抗Aβ活性作用部位實驗結(jié)果選取ST-60和ST-90進行定性分析。其中綠原酸、蘆丁、金絲桃苷和異槲皮苷通過與標準品比對保留時間及二級質(zhì)譜信息進行結(jié)構(gòu)鑒定；其他化合物通過與UNIFI軟件和數(shù)據(jù)庫的自動匹配，結(jié)合前期研究基礎及文獻報道的特征質(zhì)譜信息進行結(jié)構(gòu)鑒定。從ST-60、ST-90中共鑒定出24個化合物，其中黃酮類16個，苯丙素類4個，其他類化合物4個；其中14個共有化合物，包括黃酮類10個，苯丙素類2個，其他類化合物2個。ST-60和ST-90正負模式總離子色譜圖(total ion chromatogram，TIC)見圖2，成分鑒定結(jié)果見表1。

表1 ST-60和ST-90的化學成分解析結(jié)果

注：A為ST-60正離子模式下TIC，B為ST-60負離子模式下TIC，C為ST-90正離子模式下TIC，D為ST-90負離子模式下TIC

4 討論

Aβ是由膜蛋白淀粉樣蛋白前體蛋白經(jīng)過β分泌酶和γ分泌酶依次水解產(chǎn)生，具有神經(jīng)毒性[14]，能使自由基的產(chǎn)生增多[15]，對神經(jīng)細胞產(chǎn)生氧化應激作用，引起炎癥反應，是誘發(fā)AD的重要病因之一[16]，因此降低Aβ對神經(jīng)細胞的損傷是治療AD的重要途徑。SH-SY5Y細胞常用來制備研究神經(jīng)細胞凋亡的擬神經(jīng)細胞模型，廣泛應用于神經(jīng)細胞退行性疾病的發(fā)病機制和治療方法的研究[17]。本實驗結(jié)果顯示，ST-60和ST-90對Aβ蛋白誘導的SH-SY5Y細胞模型活性強于其他洗脫部位，且藥效呈現(xiàn)濃度依賴性，說明綠萼梅具有抗Aβ活性作用。經(jīng)UPLC-Q-TOF-MS辨識ST-60和ST-90的化學成分，共鑒定出24個化合物，其中黃酮類16個，苯丙素類4個，其他類化合物4個。從兩個洗脫活性部位中鑒定出14個共有成分，分別為蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、紫云英苷、水仙苷、異鼠李素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素、山柰酚、異鼠李素和柚皮素等10個黃酮類化合物，綠原酸和反式羥基肉桂酸等2個苯丙素類化合物，以及腺苷和十六碳二烯酸等2個其他類化合物。結(jié)果表明，綠萼梅抗Aβ活性作用的藥效物質(zhì)基礎可能是黃酮類化合物。