禹程遠(yuǎn)，陳曉靜，王姣姣，解汝娟

1.深圳市人民醫(yī)院老年病科，廣東深圳，518020；2.西安市紅會醫(yī)院內(nèi)科，陜西西安 710000；3.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)科，黑龍江哈爾濱 150000

特發(fā)性膜性腎?。↖MN）是臨床上常見的腎小球濾過屏障損傷的疾病，是成人腎病綜合征（NS）最為常見的病因，其血栓栓塞并發(fā)癥高達(dá)7%～50%［1］。疾病的發(fā)展與靜脈血栓栓塞事件發(fā)生的風(fēng)險相關(guān)［2］。目前IMN的血栓發(fā)生機(jī)制主要包括凝血功能增強(qiáng)（因子V、VIII，纖維蛋白生成增加，血小板聚集等）、抗凝作用減弱（抗凝血酶III、蛋白C的丟失）［3］，微粒表達(dá)增加等［4］。但是，常規(guī)的抗血栓治療后仍會有心血管事件的發(fā)生，且對于治療時機(jī)的選擇仍存在爭議［5］，因此，進(jìn)一步了解IMN血栓形成機(jī)制尤為重要。臨床中約有70%的IMN患者循環(huán)中抗磷脂酶A2受體（PLA2R）抗體陽性，該抗體已成為IMN診斷治療的一項指標(biāo)［6］，但血清抗體水平并不能及時準(zhǔn)確反映疾病進(jìn)展，且與腎組織中抗體表達(dá)不一致［7］，因此尋找新的指標(biāo)對于監(jiān)測疾病進(jìn)展尤為重要。近年來，在多種免疫相關(guān)性血栓疾病中發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞在各種氧化應(yīng)激環(huán)境中可生成一種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，稱為中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（NETs），由DNA、組蛋白及顆粒蛋白等部分組成，具有抗炎、促凝等功能，其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)能夠捕獲血小板、紅細(xì)胞和纖維蛋白等促凝物質(zhì)，亦能夠與循環(huán)中微粒結(jié)合為復(fù)合體，激發(fā)凝血瀑布反應(yīng)，其中組蛋白也能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)促凝表型，最終導(dǎo)致血栓形成［8-9］。研究表面IMN患者外周血中性粒細(xì)胞被大量激活［10-11］，且在發(fā)病后有活性氧簇（ROS）系統(tǒng)的激活，而后者是NETs形成過程中重要機(jī)制［12］，基于以上觀點，研究者提出IMN患者體內(nèi)存在NETs高表達(dá)，可將其可作為一種新的監(jiān)測指標(biāo)反映腎臟損傷情況以及評估血栓前狀態(tài)。正常腎臟存在三層濾過屏障，腎臟有孔內(nèi)皮細(xì)胞、基底膜以及上皮細(xì)胞，內(nèi)皮表面存在糖萼、硫酸軟骨素及透明質(zhì)酸等成分使得有孔腎臟內(nèi)皮連接緊密，蛋白無法漏出，當(dāng)內(nèi)皮受刺激后，糖萼成份被破壞，硫酸軟骨素及透明質(zhì)酸被降解，內(nèi)皮間隙增寬，大分子蛋白才得以漏出，隨著基底膜、足細(xì)胞的進(jìn)一步破壞，出現(xiàn)蛋白尿［13］。研究者考慮內(nèi)皮損傷是IMN疾病進(jìn)展的關(guān)鍵一步。正常內(nèi)皮對維持正常血流過程及出凝血平衡，因此IMN多部位血栓事件的發(fā)生與內(nèi)皮損傷密不可分。本研究擬探究NETs在加重IMN內(nèi)皮功能紊亂并促進(jìn)高凝形成、疾病進(jìn)展中的作用，為IMN的診治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 研究對象

篩選年齡在18～80歲之間且于2019年3月—2020年12月在哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科行腎活檢病理診斷為IMN，且病理分期為II、III期的患者，行雙下肢彩超或雙腎血管彩超，根據(jù)彩超對于急慢性血栓的診斷標(biāo)準(zhǔn)排除陳舊血栓影響，分為有血栓組、無血栓組各20例為IMN組，再選取健康者20例為對照組。所有人員均對此項研究知情且同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：年齡＜18歲或＞80歲，合并其他已知腎臟疾病（如糖尿病腎病、IgA腎病等）、惡性高血壓、糖尿病患者，尿路感染，尿路結(jié)石，免疫相關(guān)性疾病、惡性腫瘤病史，鐵、葉酸和維生素B12缺乏，近一個月內(nèi)抗凝劑、溶栓治療、腎毒性藥物與非甾體抗炎藥。

1.2 主要試劑

RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、胰酶細(xì)胞消化液、胎牛血清（美國Gibico）。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ScienCell（CA，USA）。 PMA、DNase I、中性粒細(xì)胞分離液、紅細(xì)胞裂解液（Sigma-Aldrich）。 PBS緩沖液（Solarbio）；中性粒細(xì)胞髓過氧化物酶試劑盒（Boster）。中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶試劑盒、TAT復(fù)合體檢測試劑盒（Blue-Gene）。 Quant-iT PicoGreen ds-DNA 試劑盒（Invitrogen）。VE-cadherin、Anti-TF、CD31、anti-human MPO、anti-human NE（abcam）。 DAPI（Hoechst）。

2 方法

2.1 外周血采集

所有研究對象于治療前，禁食8～12 h后留取肘靜脈血5 mL，采血管中含有3.2%的檸檬酸鈉，并緩慢搖勻。在采集30 min內(nèi)，將樣品在室溫下離心（200×g，10 min）得到富血小板血漿，再次離心（2 500×g，2次，每次15 min）得到乏血小板血漿，將其儲存在-80℃。

2.2 體外NETs生成及提取

采用Percoll梯度密度離心法收集血液中的中性粒細(xì)胞，并通過賴特-吉姆薩和臺盼藍(lán)染色檢測這些細(xì)胞的活性和純度，其結(jié)果不低于98%。中性粒細(xì)胞（1×106）接種于聚L-賴氨酸修飾的24孔板中，37℃孵育30 min，然后用IMN有血栓組、無血栓組或?qū)φ战M的血漿對中性粒細(xì)胞進(jìn)行處理，并在37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)4 h，用RPMI洗滌細(xì)胞，每孔加入RPMI 2 mL。然后大力搖動樣品，將上清液以20×g的速度離心5 min后收集上清液中的網(wǎng)狀物，并儲存在-20℃冰箱中備用。

2.3 免疫熒光實驗

為了進(jìn)一步觀察NETs的形成，使用免疫熒光顯微鏡觀察其結(jié)構(gòu)。首先將中性粒細(xì)胞接種到聚L-賴氨酸修飾的24孔板中，用顯微鏡觀察細(xì)胞基本貼壁后，用磷酸鹽緩沖（PBS）溶液對多聚賴氨酸氨酸爬片清洗三次，每次3～5 min。中性粒細(xì)胞在有或無刺激的情況下，加入4%多聚甲醛固定（10～15 min），PBS清洗1～2次。每孔加入100μL BSA溶液封閉30 min，吸掉封閉液，緊接著加入1∶100的彈性蛋白酶抗體（2%BSA配置），濕毛巾包裹后4℃過夜。吸走一抗，并進(jìn)行PBS清洗，加入MPO-DNA抗體，室溫下孵育30 min，PBS清洗后在避光環(huán)境下每孔加入100μL DAPI溶液，通透5 min后PBS清洗1～2次，加入二抗后，所有操作需避光，在避光環(huán)境下?lián)钙?，將防淬滅甘油滴在載玻片上，然后封片劑封片。免疫熒光顯微鏡對其進(jìn)行熒光定量分析，觀察計算中心粒細(xì)胞釋放NETs占同視野全部細(xì)胞的百分比，并進(jìn)行三次重復(fù)試驗。

2.4 凝血時間及TAT復(fù)合物測定

如先前概述方法進(jìn)行凝時間及TAT測定［14-15］。

2.5 內(nèi)皮細(xì)胞免疫熒光測定

（1）內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)：內(nèi)皮細(xì)胞的復(fù)蘇傳代，顯微鏡下觀察內(nèi)皮培養(yǎng)基情況，細(xì)胞生長至均勻的平鋪一層，進(jìn)行下一步實驗操作。用鑷子將普通細(xì)胞爬片置于24孔板中，PBS進(jìn)行沖洗（2～3次），每次5 min，清洗后備用。棄掉內(nèi)皮培養(yǎng)基中的培養(yǎng)液，清洗2次，加入1～2 mL胰酶消化，輕輕拍打瓶身，并實時在鏡下進(jìn)行觀察，致大量細(xì)胞形態(tài)變?yōu)闄E圓狀懸浮于培養(yǎng)液后，加入2 mL培養(yǎng)液終止胰酶消化。吸取液體離心（800×g，3～4 min），棄上清，于離心管中加入3～5 mL培養(yǎng)液，吸管吹打，用槍頭吸10μL左右液體，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，將ECs稀釋到細(xì)胞濃度為106/mL，將稀釋后的細(xì)胞均勻的移入24孔板。當(dāng)細(xì)胞生長覆蓋70%～80%，將之前提取出的NETs作為刺激物，刺激鋪板后的內(nèi)皮細(xì)胞24 h。（2）內(nèi)皮細(xì)胞免疫熒光步驟：細(xì)胞爬片進(jìn)行刺激處理后，PBS沖洗3次，多聚甲醛固定30 min，再次沖洗之后加入BSA封閉30 min，用VE-cadherin、TF、CD31的抗體對HUVEC進(jìn)行染色。將樣本與Alexa Fluor647、488或555結(jié)合的二抗孵育，最后加入DAPI 30 min后防淬滅甘油封片，免疫熒光顯微鏡觀察ECs的形態(tài)變化。用流式細(xì)胞術(shù)對CD31、VE-cadherin進(jìn)行檢測，結(jié)果用平均熒光強(qiáng)度表達(dá)，重復(fù)4次實驗。

2.6 外周血NETs相關(guān)指標(biāo)測定

cfDNA、MPO-DNA復(fù)合體、NE均作為患者血漿中NETs的替代指標(biāo)［16］。將采集好的血漿和試劑盒恢復(fù)至室溫，根據(jù)制造商說明，使用Quant-it PicoGreen dsDNA試劑盒定量測定IMN患者血漿樣本中的cf-DNA水平。ELISA用于定量血漿MPO-DNA復(fù)合物，如之前的描述［17］。根據(jù)提供的說明，還使用特異的ELISA試劑盒檢測NE。450 nm波長下讀取OD值，進(jìn)行MPO-DNA復(fù)合物及NE濃度計算。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 基本信息

IMN組患者血漿白蛋白、血脂、中性粒細(xì)胞、PLT、APTT、Fibrinogen、D-dimer等與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，0.01，0.001，0.0001），但有血栓組與無血栓組間對比無明顯差異，見表1。

表1 IMN患者和對照組受試者的基本特征

3.2 IMN患者外周血中NETs指標(biāo)變化

與對照組相比，IMN伴有血栓和不伴有血栓患者外周血MPO-DNA復(fù)合物、cell-freeDNA、NE水平均明顯升高差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），有血栓組較無血栓組水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 IMN患者和對照組循環(huán)血液中的NETs相關(guān)指標(biāo)

3.3 IMN患者血漿刺激對NETs生成的影響

IMN患者組可見明顯的絲狀結(jié)構(gòu)，并用免疫熒光觀察DNA、MPO、NE，發(fā)現(xiàn)MPO、NE均黏附在DNA鏈上，其含量較對照組明顯增加，同時對能夠產(chǎn)生NETs的中性粒細(xì)胞百分比進(jìn)行比較，IMN組患者與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），有血栓組與無血栓組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 IMN血漿更有可能促進(jìn)中性粒細(xì)胞的細(xì)胞外陷阱。（免疫熒光×400）

3.4 IMN患者外周血中NETs對凝血功能的影響

與對照組相比，IMN組患者CT明顯縮短，有血栓組比無血栓組時間縮短更明顯。用anti-TF、DNase可有效抑制NETs導(dǎo)致的促凝影響，且DNaseI作用更強(qiáng)。而IMN組患者較對照組患者凝血酶-抗凝血酶水平更高，有血栓組較無血栓組更明顯，用anti-TF、DNase可減少TAT復(fù)合物生成，見圖3。

圖3 NETs促進(jìn)了IMN患者的促凝血活性

3.5 NETs異常生成對內(nèi)皮功能的影響

NETs刺激組ECs皺縮，細(xì)胞間距離增大，CD31的表達(dá)降低，TF表達(dá)增加，使得內(nèi)皮細(xì)胞向促凝活性轉(zhuǎn)變，且VE-cadherin的表達(dá)降低，細(xì)胞邊緣顯著延長。流式細(xì)胞儀對CD31、VE-cadherin表達(dá)定量分析，顯示二者菌顯著降低，見圖4。

圖4 NETs損害內(nèi)皮細(xì)胞并促進(jìn)其促凝表型（免疫熒光×400）

4 討論

本文通過對IMN高凝狀態(tài)的探究，提出了NETs可作為免疫與血栓聯(lián)系的橋梁，可作為一種新的監(jiān)測指標(biāo)，反映疾病進(jìn)展程度。研究者得出以下結(jié)果：（1）IMN患者血漿更容易促使中性粒細(xì)胞表達(dá)NETs，且隨著凝血的加重，NETs升高更明顯，也說明NETs能更敏感地反映高凝狀態(tài)的形成。（2）NETs可明顯縮短CT，促進(jìn)凝血酶的生成，而抗組織因子抗體和DNase I可減弱NETs促凝作用。（3）NETs高表達(dá)可損傷內(nèi)皮細(xì)胞，使得內(nèi)皮結(jié)構(gòu)改變，同時向促凝表型轉(zhuǎn)化。NETs不僅可作為疾病早期血栓并發(fā)癥程度的監(jiān)測指標(biāo)，同時也能為抗血栓治療提供新的方向。

之前對于IMN血栓相關(guān)性的研究認(rèn)為，其與血小板活化、凝血因子啟動、抗凝物質(zhì)減少、纖溶抵抗［17］等因素有關(guān)，近些年又有人提出微粒促進(jìn)高凝狀態(tài)形成［18］，現(xiàn)有抗栓治療并不能很好地解決血栓并發(fā)癥的發(fā)生，目前臨床上主要以血漿白蛋白水平作為預(yù)防性抗凝治療指標(biāo)，但治療效果不佳，因此對于治療時機(jī)的選擇仍存在爭議。這就需要我們進(jìn)一步探究IMN患者血栓發(fā)生機(jī)制，尋找新的監(jiān)測指標(biāo)。IMN患者是一種免疫相關(guān)的腎臟疾病，隨著免疫系統(tǒng)的激活，多種炎癥因子、炎癥介質(zhì)高表達(dá)，促進(jìn)凝血系統(tǒng)的激活［19］，但目前主要聚焦于T、B細(xì)胞的研究，固有免疫細(xì)胞參與疾病的過程涉及相對較少，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)IL-17A在腎臟損傷中發(fā)揮重要作用，與其伴隨的中性粒細(xì)胞的聚集有關(guān)［20］。有Th17介導(dǎo)的炎癥的MN患者有更多的靜脈血栓事件的發(fā)生，利妥昔單抗治療可誘導(dǎo)Th1和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞細(xì)胞因子，但并不能有效抑制Th17細(xì)胞，伴有IL-17升高的MN患者預(yù)后較差。IL-17與中性粒細(xì)胞作用密切相關(guān)，如果對中性粒細(xì)胞參與IMN患者發(fā)病機(jī)制進(jìn)行相關(guān)性研究，抗體合并相應(yīng)抑制劑治療是否能改善預(yù)后［21］。因此研究者將中性粒細(xì)胞作為主要研究對象。而內(nèi)皮作為第一道屏障，在凝血-抗凝平衡的維持，血栓的發(fā)生過程起到重要作用，因此研究者認(rèn)為內(nèi)皮在IMN患者血栓的發(fā)生中也起著重要作用。本文主要探究了中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用對IMN患者高凝狀態(tài)形成的影響。

NETs在心腦血管、腎臟相關(guān)等疾?。?2］中已有不少報道，從開始的抗炎研究，到后期的促炎、促凝的研究，對于NETs的了解越來越深入。在IMN中對于NETs的研究目前仍較少，2002年有相關(guān)研究報導(dǎo)游離的磷脂酶A2（sPLA2-IB）與中性粒細(xì)胞表面相關(guān)受體—PLA2R1結(jié)合，使得p38MAPK信號激活，進(jìn)而刺激了NE釋放和細(xì)胞粘附，同時sPLA2與受體結(jié)合，激活下游分子后具有促凋亡作用。在多種疾病研究中發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞存在一種新的死亡方式，稱之為NETosis，其在炎癥和血栓中發(fā)揮重要作用。IMN患者血漿抗PLA2R抗體明顯增加，那么IMN中增加的抗PLA2R抗體是否能與中性粒細(xì)胞反應(yīng)，發(fā)生類似凋亡作用，目前仍未被證實，這也許是IMN患者外周血中NETs生成增加的重要原因。本文主要證明了IMN患者中存在NETs的高表達(dá)，但并沒有對其生成機(jī)制進(jìn)一步探究，最近的報道證明，空氣中的PM2.5生成可促進(jìn)IMN患者體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)一步促進(jìn)NETs生成，NETs的生成促進(jìn)PLA2R抗體表達(dá)［12］。因此對于抗體與NETs出現(xiàn)的先后順序仍具有爭議，這也是本次研究我們未將抗體與中性粒細(xì)胞進(jìn)行分析的原因，我們需要進(jìn)一步探究，后期需通過構(gòu)建動物模型進(jìn)行研究，目前血漿抗體水平變化與蛋白尿變化，疾病緩解并不一致［23］，如果能夠?qū)⒖贵w與NETs的相互關(guān)系了解清楚，那么對于IMN的治療將會有很大意義。

腎臟內(nèi)皮細(xì)胞作為三層濾過屏障之一，在蛋白尿的形成中發(fā)揮重要作用。生理情況下，其存在電荷屏障和分子屏障，在IMN中，先是電荷屏障破壞，一些小分子蛋白能夠濾過，隨著疾病的加重，內(nèi)皮結(jié)構(gòu)改變，間隙增寬，會導(dǎo)致大分子蛋白也濾過，雖然對于濾過屏障的研究，大多數(shù)人認(rèn)為足細(xì)胞骨架發(fā)揮重要作用，但不可否認(rèn)，內(nèi)皮作為第一道屏障，只有當(dāng)其破壞越嚴(yán)重，才能出現(xiàn)越來越多的蛋白向足細(xì)胞屏障濾過。同時內(nèi)皮也是凝血-抗凝系統(tǒng)平衡的重要調(diào)節(jié)物質(zhì)，而IMN患者中NETs的高表達(dá)導(dǎo)致內(nèi)皮損傷，因此呈現(xiàn)出大量蛋白尿以及高凝的表現(xiàn)。而DNaseI、抗組織因子抗體的抑制能夠減輕NETs損傷，這也許能夠作為一種新的治療手段。內(nèi)皮表面表達(dá)CD31，VE-cadherin是細(xì)胞間重要的連接分子，我們的體外細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)NETs刺激內(nèi)皮細(xì)胞后，CD31、VE-cadherin水平均降低，同時內(nèi)皮發(fā)生皺縮、間隙增大等結(jié)構(gòu)改變，證明了NETs通過對內(nèi)皮結(jié)構(gòu)的破壞影響其功能。

之前對于IMN患者高凝機(jī)制的研究多以腎病綜合征病理類型劃分，或以疾病病理分期進(jìn)行研究，考慮到我們?nèi)朐夯颊咧蠭MN患者病理類型多以II、III期為主，且I期、IV期患者的臨床表現(xiàn)以及病理并不典型，以及多合并其他疾病發(fā)生，如微小病變性腎病或狼瘡性腎炎，因此我們選擇了較為典型的II、III期IMN患者，且臨床指標(biāo)多提示高凝，我們根據(jù)彩超結(jié)果排除陳舊性血栓的影響將其分為有血栓組和無血栓組，結(jié)果證實了NETs升高越明顯，血栓發(fā)生幾率越大。在患者篩選中對照組患者較實驗組年齡偏低，是由于樣本量問題，在篩血栓組過程中擴(kuò)大了年齡范圍，因此實驗組年齡普遍偏高，但在有血栓組和無血栓組中，年齡不作為影響疾病嚴(yán)重程度的因素，對照組與實驗組本身也不能排除年齡對于血管狀態(tài)的影響，但對于NETs生成的影響作用不大，其仍主要是與中性粒細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。而且無血栓組與對照組年齡并無明顯差別，可通過這二者的對比，相對排除年齡因素對于疾病指標(biāo)的影響。

綜上所述，研究證明了IMN患者外周血中高表達(dá)的NETs可反映腎臟內(nèi)皮損傷程度，同時能夠及時監(jiān)測高凝狀態(tài)的形成，通過有效地抑制，對于疾病的緩解具有重要意義，且有望縮短目前治療病程，減少并發(fā)癥的發(fā)生。為預(yù)防和治療開拓了新的思路，提供了新的靶點。