許曉娜，許二平，王曉鴿，2

1.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046； 2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000

強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)屬于風(fēng)濕免疫系統(tǒng)疾病，患者主要是青壯年男性[1]，可引起繼發(fā)性骨量減少甚至骨質(zhì)疏松[2]，亞洲國(guó)家發(fā)病率為1.67%[3]，其中我國(guó)發(fā)病率約為0.2%～0.4%[4]。雖然AS的發(fā)病率不是很高，但此病有致畸的可能性[5]，須引起重視。強(qiáng)直性脊柱炎的病因病機(jī)尚未完全闡明，多認(rèn)為與遺傳因素和環(huán)境因素相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，HLA-B27、MHC、IL23R、ERAP1、KIF12B、RUNX3、TNF等為AS的遺傳易感基因[6-12]，核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)、白細(xì)胞介素-23(interleukin-23，IL-23)/輔助性T細(xì)胞17(T helper cell 17，Th17)[13]等相關(guān)通路與AS的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。此外，微生物感染也是引起AS的重要原因，目前研究較多的有肺炎克雷伯菌感染[14]、衣原體感染[15]等。

羌活勝濕湯由羌活、獨(dú)活、藁本、甘草、蔓荊子、防風(fēng)、川芎組成，搭配經(jīng)典，配伍巧妙，方中羌活擅長(zhǎng)祛除上半身風(fēng)濕，獨(dú)活擅長(zhǎng)祛除下半身風(fēng)濕，兩藥合用，則一身風(fēng)濕盡除，疏通關(guān)節(jié)而能通痹止痛，同為君藥；防風(fēng)和藁本俱為祛風(fēng)藥，防風(fēng)祛風(fēng)除濕以解表，藁本辛散溫通散寒濕邪，兩藥合用，助羌活、獨(dú)活祛風(fēng)勝濕之力，為臣藥；川芎辛溫香燥，走而不守，能活血行氣，祛風(fēng)止痛，蔓荊子祛風(fēng)除濕利關(guān)節(jié)，合為佐藥；炙甘草為使藥，調(diào)和諸藥；全方共奏祛風(fēng)勝濕之效，臨床治療強(qiáng)直性脊柱炎效果顯著，但其作用機(jī)理尚未明確，本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測(cè)其作用靶點(diǎn)，探討其可能的作用機(jī)理。

1 資料與方法

1.1 羌活勝濕湯活性成分檢索在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)依次檢索羌活、獨(dú)活、藁本、甘草、蔓荊子、防風(fēng)、川芎的化學(xué)成分，以口服利用度(oral availability，OB)≥30%、類(lèi)藥性(drug likeness，DL)≥0.18為條件進(jìn)行篩選，得到羌活勝濕湯的活性成分，并通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步預(yù)測(cè)所有活性成分的潛在靶點(diǎn)，將獲得的靶點(diǎn)數(shù)據(jù)錄入U(xiǎn)niProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。采用Cytoscape3.8.2 軟件，構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2 強(qiáng)直性脊柱炎相關(guān)靶點(diǎn)的獲取在GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//cipotato.org/genebankcip/)及人類(lèi)基因數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//www.genecards.org/，GeneCards)以“Ankylosing Spondylitis(AS)”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，獲取強(qiáng)直性脊柱炎的相關(guān)靶點(diǎn)。采用Venn2.1.0(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)在線(xiàn)平臺(tái)獲取藥物靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)的交集靶點(diǎn)，即為羌活勝濕湯治療強(qiáng)直性脊柱炎的潛在靶點(diǎn)。

1.3 蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建把藥物和疾病的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING(https：//string-db.org/)在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)，物種設(shè)置為人(Homo sapiens)，構(gòu)建交集靶點(diǎn)之間的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 富集分析將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape(https：//metascape.org/gp/index.html)在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)，物種設(shè)置為智人(Homo sapiens)，選擇自定義分析，進(jìn)行基因本體(gene ontology，GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(shū)(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析，并將富集結(jié)果可視化。

2 結(jié)果

2.1 羌活勝濕湯活性成分篩選在TCMSP檢索得到羌活勝濕湯組方中藥的化學(xué)成分，以O(shè)B≥30%和DL≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，得到羌活勝濕湯活性成分61個(gè)，其中羌活10個(gè)，獨(dú)活6個(gè)，甘草16個(gè)，藁本1個(gè)，蔓荊子14個(gè)，防風(fēng)10個(gè)，川芎4個(gè)；預(yù)測(cè)得到羌活勝濕湯活性成分相關(guān)靶點(diǎn)265個(gè)。

2.2 疾病靶點(diǎn)及藥物治療AS的潛在靶點(diǎn)的獲取通過(guò)檢索 GeneBank和 GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)，去掉重復(fù)值后得到疾病靶點(diǎn)1 672個(gè)。將羌活勝濕湯活性成分的相關(guān)靶點(diǎn)與強(qiáng)直性脊柱炎疾病相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行映射，得到26個(gè)交集靶點(diǎn)，即為羌活勝濕湯治療強(qiáng)直性脊柱炎的潛在靶點(diǎn)，使用Venn圖對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化。見(jiàn)圖1。

2.3 “藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖利用 Cytoscape3.8.2 軟件構(gòu)制“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，圖中共有 311個(gè)節(jié)點(diǎn)，其中藥物活性成分61個(gè)，藥物節(jié)點(diǎn)6個(gè)(藁本成分只有一個(gè)且為共同成分，故未顯示)，靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)239個(gè)。圖中淺青色代表獨(dú)活活性成分，淺黃色代表蔓荊子活性成分，淺橘色代表防風(fēng)活性成分，淺綠色代表甘草活性成分，淺粉色代表川芎活性成分，棕色代表羌活活性成分，淺藍(lán)色代表靶點(diǎn)。

圖1 交集靶點(diǎn)的Venn圖

注：QH：羌活；DH：獨(dú)活；GC：甘草；FF：防風(fēng)；CX：川芎；MJ：蔓荊子圖2 “藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖，圖中共有26個(gè)節(jié)點(diǎn)，101條邊，平均節(jié)點(diǎn)數(shù)為7.77，節(jié)點(diǎn)代表靶蛋白，邊代表靶蛋白之間的相互作用關(guān)系。見(jiàn)圖3。

2.5 GO功能富集分析利用Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)羌活勝濕湯作用于強(qiáng)直性脊柱炎的有效作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析得到GO條目620條，其中生物學(xué)過(guò)程(biological process，BP)有475條，主要有脂質(zhì)生物合成過(guò)程、對(duì)有毒物質(zhì)調(diào)節(jié)激素水平的反應(yīng)、輔助因子代謝過(guò)程等；分子功能(molecular function，MF)共124條，主要是影響酶的活性，如氧化還原酶活性、類(lèi)固醇羥化酶活性等；細(xì)胞組成(cellular component，CC)共21條，涉及細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)、細(xì)胞器包膜囊腔、線(xiàn)粒體包膜等。見(jiàn)圖4-圖6。

圖3 交集靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 GO富集分析中的BP分析圖

圖5 GO富集分析中的MF分析圖

2.6 KEGG通路富集分析利用Metascape在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)羌活勝濕湯治療強(qiáng)直性脊柱炎的有效作用靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析。以P<0.05、FDR<0.05為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，共得到28條信號(hào)通路，主要有類(lèi)固醇激素生物合成通路、NOD樣受體信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路等。見(jiàn)表1。

表1 KEGG通路結(jié)果分析

圖6 GO富集分析中的CC分析圖

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為強(qiáng)直性脊柱炎腎虛為本，病在督脈[16]。國(guó)家中醫(yī)藥管理局2010年制定的《22個(gè)專(zhuān)業(yè)95個(gè)病種中醫(yī)診療方案》中將本病分為腎虛督寒型及腎虛濕熱型。督脈陽(yáng)氣不足，風(fēng)、寒、濕、熱等邪入侵，督脈起于胞中，行于脊背，腎陽(yáng)不足，則督脈無(wú)以主一身之陽(yáng)經(jīng)，同時(shí)陽(yáng)虛寒凝，寒則痛甚，故脊背痛甚[17]。因此，中醫(yī)將AS歸屬于“痹證”“大僂”“骨痹”“竹節(jié)風(fēng)”“龜背風(fēng)”“腎痹”“脊強(qiáng)”“筋痹”“督脈病”“背僂”“腰痛”等范疇[18-20]?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》記載：“骨痹不已，復(fù)感于邪，內(nèi)舍于腎，腎痹者，尻以代踵，脊以代頭”，意指不能直立行走，臀部代替雙足，脊柱彎曲程度嚴(yán)重，從遠(yuǎn)處看像頭一樣，形象的描述了本病引起的脊柱及髖關(guān)節(jié)的畸形?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》中還記載“陰氣者，開(kāi)闔不得，寒氣從之，就生大僂”。王冰著說(shuō)“身體俯曲，不能直立，僂，脊柱彎曲”，也是對(duì)本病的描述。中醫(yī)認(rèn)為痹癥的外因是風(fēng)寒濕，風(fēng)寒濕三氣雜至，合而為痹，內(nèi)因與稟賦不足，先天腎精虧虛，督脈空虛有關(guān)，內(nèi)外邪氣相合，阻礙機(jī)體陽(yáng)氣運(yùn)行，不通則痛而發(fā)病。因此，AS臨床治療時(shí)扶正祛邪兼顧，方能治本。羌活勝濕湯有祛風(fēng)勝濕之效，臨床治療AS效果顯著。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究顯示，川芎通過(guò)調(diào)節(jié)NOD樣受體(NOD-like receptors，NLRs)、T細(xì)胞受體、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、Toll樣受體(Toll-like receptors，TLR)、環(huán)磷腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)、磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K-Akt)等信號(hào)通路治療AS[21]。川芎的成分之一楊梅素具有免疫調(diào)節(jié)的作用，有益于疼痛性疾病的治療[22]，可以下調(diào)NF-κB結(jié)合活性，從而抑制脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的IL-12的產(chǎn)生[23]。研究發(fā)現(xiàn)，獨(dú)活治療AS有26個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)[24]，其中人類(lèi)白細(xì)胞抗原B27(human leucocyte antigen-B27，HLA-B27)和白細(xì)胞介素 23 受體(interleukin-23 receptor，IL-23R)基因單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)[25]是AS發(fā)病的公認(rèn)假設(shè)；Toll樣受體、NF-κB、NOD樣受體、腸道免疫、T細(xì)胞受體等是治療AS的免疫相關(guān)通路；脂肪因子、Janus激酶(janus kinase，JAK)/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducer and activator of transcription，STAT)通路等是治療炎癥的通路；Wnt /β-catenin 信號(hào)[26]、TNF、破骨細(xì)胞分化、類(lèi)固醇激素的合成等是治療骨代謝的相關(guān)通路。姜平等[27]的數(shù)據(jù)挖掘分析顯示，治療AS最常用的組合是獨(dú)活-防風(fēng)，應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析此藥對(duì)共含有21個(gè)有效成分，對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)237個(gè)，其中關(guān)鍵成分可能是β-谷甾醇、漢黃芩素等。段凱旋等[28]研究顯示，羌活-獨(dú)活藥對(duì)共有15個(gè)抗炎成分，作用于49個(gè)靶點(diǎn)，共同參與47個(gè)生物過(guò)程。謝恒韜等[29]研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠模型中，羌活能夠降低炎癥中NF-κB的水平，和強(qiáng)直性脊柱炎的發(fā)病相關(guān)。以上研究表明，羌活、獨(dú)活、防風(fēng)等羌活勝濕湯的組方藥材均可通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多途徑發(fā)揮治療AS的作用。

本文探討了中藥復(fù)方羌活勝濕湯治療AS的可能靶點(diǎn)和通路發(fā)現(xiàn)，疾病和藥物的交集靶點(diǎn)有26個(gè)，羌活勝濕湯主要成分有升麻素苷、阿魏酸、甘草苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、甘草酸、羌活醇、藁本內(nèi)酯、蛇床子素等，通過(guò)調(diào)節(jié)NOD樣受體、T細(xì)胞受體、腫瘤壞死因子-α、Toll樣受體、環(huán)磷腺苷、類(lèi)固醇激素的合成等通路，作用于HLA-B27和 IL-23R SNP等強(qiáng)直性脊柱炎疾病靶點(diǎn)。說(shuō)明羌活勝濕湯可通過(guò)多途徑、多靶點(diǎn)、多層次作用于AS。該研究為深入理解藥物-靶點(diǎn)之間相互作用提供了重要參考信息，同時(shí)為中醫(yī)藥治療強(qiáng)直性脊柱炎的機(jī)制研究做出探索。