邢晨晨，張效威，徐江雁

河南中醫(yī)藥大學，河南 鄭州 450046

糖尿病腎臟疾病(diabetic kidney disease，DKD)是糖尿病引起的嚴重微血管并發(fā)癥，以持續(xù)性蛋白尿、水腫、高血壓、腎功能持續(xù)性下降、心血管事件頻發(fā)等為表現(xiàn)的臨床綜合征[1]，是全球慢性腎臟病的主要原因，也是目前導致終末期腎臟病(end-stage-renal-disease，ESRD)的首要原因[2]。調查結果顯示，全球范圍內約20%的糖尿病患者進展為DKD[3]，而我國DKD患病率高達40%[4]。DKD發(fā)展至后期需要進行血液透析，甚至腎臟移植，嚴重影響患者的生存質量，并且給家庭和社會帶來沉重的經濟負擔。因此，盡早采取干預措施，阻止或延緩DKD病程進展至ESRD是目前治療DKD的重要目標之一。臨床實踐過程中針對DKD的治療主要以控制血壓、降低血糖以及抑制腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)等為主，然而上述治療藥物并不能有效阻止DKD的持續(xù)進展。中醫(yī)藥在防治DKD方面有明顯的優(yōu)勢，能夠有效減少蛋白尿生成，延緩病程進展，保護腎功能等。

熟地黃-山茱萸是治療腎病的常用藥對[5]，也是益腎通絡方中具有補益肝腎功能的重要藥對。熟地黃性味甘溫，入肝腎經，既能補益肝腎、填精益髓，又能補血養(yǎng)虛；山茱萸味酸澀質潤，溫而不燥，補益肝腎，既能益精助陽，還能收斂固澀?，F(xiàn)代藥理研究表明，熟地黃能調節(jié)血脂、血糖，并對心腦血管系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、中樞神經系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等有良性調節(jié)作用[6]。山茱萸能保護肝腎功能，對神經、心腦系統(tǒng)具有保護作用等[7]。網絡藥理學利用系統(tǒng)生物學、計算生物學和多向藥理學等技術方法，構建成分-靶點-疾病網絡，研究藥物對疾病的分子作用機制，為中藥復雜成分的研究提供了有效方法[8]。分子對接技術是采用計算機技術，通過化學計量學方法模擬配體與受體之間的幾何匹配、能量匹配，并計算二者之間的結合力，以尋找二者最佳的結合模式[9]?；诖?，本研究利用網絡藥理學對熟地黃-山茱萸治療DKD的分子作用機制進行探討，并利用分子對接方法進行驗證，以期為熟地黃-山茱萸防治DKD藥效機制的闡釋以及深入開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 熟地黃-山茱萸有效成分篩選通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫及分析平臺[10](traditional Chinese medicine systems pharmacology，TCMSP)和中藥分子機制的生物信息學分析工具[11](bioinformatics analysis tool for molecular mechanism of traditional Chinese medicine，BATMAN-TCM)以及中藥綜合數(shù)據(jù)庫(traditional Chinese medicines integrated database，TCMID)，以“熟地黃”和“山茱萸”為關鍵詞進行檢索。對TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索到的相關成分以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥20%[12]、類藥性(drug-like，DL)≥0.1[13]為條件進行篩選。對BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫和TCMID數(shù)據(jù)庫檢索到的化學成分通過Pubchem數(shù)據(jù)庫[14]獲取成分的Canonical SMILES號保存并導入SwissADME[15](http：//www.swissadme.ch/)，借助該平臺對熟地黃和山茱萸的有效成分進行篩選，同時查閱《中華人民共和國藥典》(2020版)及中國知網相關文獻補充被遺漏的活性成分。

1.2 熟地黃-山茱萸活性成分的作用靶點和DKD靶點的獲取通過TCMSP和BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫獲得有效成分的靶點信息。利用蛋白質數(shù)據(jù)庫Uniprot[16](http：//www.uniprot.org)對收集到的靶點信息進行標準化處理，設定“reviewed”和物種為“Homo Sapiens”，將靶點轉化為對應的基因名稱。利用SwissTargetPrediction[17](http：//www.swisstargetprediction.ch/)和STITCH平臺預測相關化合物的潛在靶點。將以上4個數(shù)據(jù)庫檢索到的化合物靶點合并，刪除重復基因，得到熟地黃-山茱萸活性成分的作用靶點。以“diabetic kidney disease”為關鍵詞，搜索OMIM(Online Mendelian Inheritance in Man)數(shù)據(jù)庫[18](http：//www.omim.org)、DisGeNet數(shù)據(jù)庫[19](http：//www.disgenet.org/home/)、DRUGBANK數(shù)據(jù)庫[20](http：//www.drugbank.ca/)、Gene-Cards數(shù)據(jù)庫[21](https：//www.genecards.org)得到相關靶點。將4個數(shù)據(jù)庫獲得疾病靶點合并后刪除重復靶點，獲得DKD靶點。將熟地黃-山茱萸活性成分的作用靶點和DKD靶點進行映射，得到熟地黃-山茱萸治療DKD的潛在作用靶點。

1.3 熟地黃-山茱萸活性成分-DKD靶點PPI網絡構建將熟地黃-山茱萸治療DKD的潛在作用靶點上傳至STRING數(shù)據(jù)庫[22](http：//string-db.org)，選擇物種為“Homo Sapiens”，選擇靶點關聯(lián)置信度為0.70，并隱藏游離節(jié)點，進行蛋白互作(protein-protein interaction，PPI)分析，構建PPI網絡，將獲得的數(shù)據(jù)導入Cytoscape3.8.2軟件制作PPI網絡圖。

1.4 熟地黃-山茱萸干預DKD的富集分析將熟地黃-山茱萸干預DKD的潛在作用靶點導入DAVID數(shù)據(jù)庫[23](https：//david.ncifcrf.gov/)，進行基因本體(gene ontology，GO)功能富集分析、京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析，設置P<0.05進行篩選，最終選取符合條件的前10位GO功能條目和前20位KEGG通路條目，利用微生信平臺進行可視化制圖，并利用Cytoscape 3.8.2軟件構建靶點-信號通路網絡圖。

1.5 熟地黃-山茱萸干預DKD的關鍵成分與核心靶點的分子對接將進行分子對接關鍵成分的sdf格式文件利用OpenBabel-3.1.1轉化為pdb格式文件。利用RCSBPDB數(shù)據(jù)庫[24](https//：www.rcsb.org/)下載靶點蛋白的三維晶體結構。利用分子對接模擬軟件Autodock Tools1.5.6對蛋白及化合物進行去水、加氫、計算電荷數(shù)等前期處理后進行對接模擬計算。若結合能<0 kcal·mol-1表明靶點蛋白與化合物自然狀態(tài)下可自發(fā)結合，結合能<-1.2 kcal·mol-1表明靶點蛋白與化合物對接結果良好，結合能越小，表明化合物與蛋白之間結合能力越佳。通過Pymol軟件對得分較高且構象較穩(wěn)定的對接結果進行可視化。

2 結果

2.1 熟地黃-山茱萸活性成分及干預DKD靶點預測獲得熟地黃活性成分11種，山茱萸活性成分42種，同時檢索得到與53種活性成分相對應的靶點175個。此外，根據(jù)數(shù)據(jù)庫檢索結果，得到4 232個與DKD治療相關的靶點。將熟地黃-山茱萸有效成分對應的175個靶點與4 232個DKD關聯(lián)靶點，利用Venny2.1進行映射后，獲得100個共同靶點(見圖1)。

圖1 熟地黃-山茱萸與DKD共同靶點韋恩圖

2.2 熟地黃-山茱萸潛在活性成分-靶點-疾病網絡構建利用Cytoscape 3.8.2軟件構建熟地黃-山茱萸干預DKD的“活性成分-靶點-疾病”網絡，見圖2，菱形代表疾病，圓形代表靶點，六邊形代表活性成分。網絡中共有活性成分節(jié)點53個，靶點節(jié)點100個，節(jié)點中相互作用的邊358條。根據(jù)網絡拓撲學性質分析結果顯示，多種成分干預一個靶點，一種成分也能干預多個靶點，體現(xiàn)了熟地黃-山茱萸多成分、多靶點干預DKD的協(xié)同作用機制，主要成分拓撲分析指標見表1。

注：藍色為活性成分，粉色為靶點，綠色為疾病圖2 熟地黃-山茱萸干預DKD的成分-靶點-疾病網絡圖

表1 熟地黃-山茱萸關鍵成分網絡節(jié)點特征參數(shù)

2.3 PPI網絡構建及關鍵靶點篩選通過STRING和Cytoscape 3.8.2軟件對100個交集靶點進行分析處理后，得到共有99個節(jié)點和962條邊的PPI網絡，網絡中每個節(jié)點的大小和顏色的深淺反映其度值的大小(圖3)。通過拓撲學性質分析，度值排名前10位的關鍵靶點分別為AKT1、TP53、VEGFA、JUN、CASP3、PPARG、STAT3、ESR1、PTGS2、FOS，具體拓撲參數(shù)見表2。

圖3 熟地黃-山茱萸干預DKD的PPI網絡

表2 熟地黃-山茱萸主要活性成分靶點網絡節(jié)點特征參數(shù)

2.4 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析通過DAVID平臺對100個交集靶點進行GO功能富集分析(P<0.05)，共得到408條條目，其中生物過程(biological process，BP)295條，分子功能(molecular function，MF)77條，細胞組分(cell composition，CC)36條，各類別排名靠前的條目見圖4，長度越長表示富集在該條目上的基因越多，顏色越深表示富集越顯著。通過GO功能富集分析推測其細胞組分主要涉及胞質溶膠、核染色質、質膜、核質、轉錄因子復合體等方面；生物過程主要涉及針對藥物反應、雌二醇反應、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控、一氧化氮生物合成過程的正調控、老化、缺氧反應等方面；分子功能主要涉及酶結合、蛋白質結合、轉錄因子結合、類固醇結合等方面。通過KEGG通路分析得到P<0.05的通路共89條，結合DKD的疾病特點，提示熟地黃-山茱萸可能通過HIF-1信號通路、細胞凋亡相關信號通路、p53信號通路、PI3K-Akt信號通路、T細胞受體信號通路等發(fā)揮治療DKD的作用，選取富集程度高的前20條通路進行可視化，氣泡越大，表示富集在該條通路上的基因越多，顏色越深表示富集程度越顯著，見圖5。利用Cytoscape 3.8.2軟件制作熟地黃-山茱萸干預DKD的活性成分-靶點-信號通路網絡圖，見圖6，進一步說明靶點和信號通路對熟地黃-山茱萸防治DKD的重要作用。

注：綠色為BP分析；黃色為 CC分析；紫色為 MF分析圖4 熟地黃-山茱萸干預DKD關鍵靶點GO功能富集分析柱狀圖

2.5 分子對接為進一步驗證關鍵靶點與成分的可靠性，根據(jù)疾病，選取β-谷甾醇、豆甾醇、漢防己甲素作為分子對接藥效成分分別與核心靶點AKT1(PDBID：1UNQ)、TP53(PDBID：6VIP)、VEGFA(PDBID：5DN2)、JUN(PDBID：5QS8)、CASP3(PDBID：3H0E)進行分子對接模擬計算，結果顯示，關鍵靶點與藥效成分最低結合能均<-1.2 kcal·mol-1，說明預測的成分和靶點均有良好的對接活性，見表3，其中對接得分最高的是JUN-豆甾醇，分值為-9.27 kcal·mol-1，得分最低的是VEGFA-漢防己甲素，分值為-4.72 kcal·mol-1。將以上對接結果通過Pymol軟件對得分較高且構想象較穩(wěn)定的靶蛋白與化合物對接結果進行可視化，見圖7。

圖5 熟地黃-山茱萸干預DKD關鍵靶點KEGG功能富集分析氣泡圖

圖6 熟地黃-山茱萸干預DKD活性成分-靶點-信號通路網絡圖

表3 熟地黃-山茱萸核心成分與關鍵靶點分子對接結果

注：A：AKT1-豆甾醇；B：AKT1-漢防己甲素；C：TP53-漢防己甲素；D：VEGFA-β谷甾醇；E：JUN-豆甾醇；實線為氫鍵作用；虛線為疏水作用圖7 熟地黃-山茱萸成分與核心靶點分子對接結果(部分)

3 討論

DKD發(fā)病隱匿，是糖尿病微血管并發(fā)癥之一。腎小球硬化和腎間質纖維化是其最主要的病理改變。DKD發(fā)病機制復雜，至今仍不明確，可能涉及糖代謝異常、微循環(huán)障礙、氧化應激、炎癥反應、細胞自噬等方面[25]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥干預DKD在改善腎功能，減輕蛋白尿，延緩病程進展，提高患者生活質量等方面有重要作用。

通過對熟地黃-山茱萸治療DKD活性成分和關鍵靶點的網絡藥理學研究發(fā)現(xiàn)，熟地黃-山茱萸中有53個潛在活性成分可能通過100個關鍵靶點對DKD起到治療作用，主要成分包括β-谷甾醇、豆甾醇、漢防己甲素、沒食子酸等。其中β-谷甾醇及豆甾醇度值排名靠前，β-谷甾醇為山茱萸中的活性成分，在每100 g山茱萸中含量高達56.4 mg，構成比為92.6%[26]；豆甾醇為熟地黃中的活性成分，雖未查到熟地黃與豆甾醇的含量研究，但已有研究證實，二者治療DKD作用顯著[27-28]，推測其可能為熟地黃-山茱萸防治DKD的關鍵活性成分。同時，分子對接結果顯示，β-谷甾醇、豆甾醇、漢防己甲素與關鍵靶點VEGFA、AKT1、CASP3、TP53、JUN均有良好的對接活性。研究發(fā)現(xiàn)，在鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠模型治療中，漢防己甲素可能通過激活Nrf2/HO-1信號通路，發(fā)揮其抗炎、抗氧化應激等作用，從而減少蛋白尿，降低尿素氮，有效抑制糖尿病發(fā)展進程，延緩腎臟損害[29]。β-谷甾醇屬于植物甾醇類化合物，具有抗炎、抗氧化、調節(jié)骨代謝、調節(jié)免疫等多種藥理作用。研究表明，β-谷甾醇能增加酪氨酸磷酸酶的活性，降低核因子-κB水平，減少趨化因子的表達，同時增強抗炎因子白細胞介素-10的活性，從而減輕炎癥反應[30]。β-谷甾醇具有保護腎臟的作用，它能夠降低尿素、尿酸、肌酐等生化參數(shù)指標以及改善腎小管壞死等腎臟病理變化[27]。豆甾醇具有抗糖尿病、抗氧化的特性，有助于預防糖尿病及其腎臟并發(fā)癥。研究表明，豆甾醇通過改善氧化應激，調節(jié)抗氧化酶水平，在預防糖尿病及其并發(fā)癥中起到重要作用[28]。豆甾醇可能通過抑制甲狀腺激素的釋放，從而刺激胰島素的分泌，實現(xiàn)降低血糖的目的[31]。研究表明，沒食子酸通過抑制氧化應激反應，能夠有效降低甲基乙二醛誘導的糖尿病腎病小鼠的血糖水平，改善病理組織，減少蛋白尿，保護腎功能，延緩糖尿病腎臟疾病的發(fā)展進程[32]。沒食子酸對血管緊張素轉化酶有抑制作用，而血管緊張素轉化酶抑制劑已廣泛用于DKD的臨床治療，能有效調節(jié)肌酐、尿素氮的水平，改善肌酐清除率，保護腎功能[33]。由此推測，這些度值排名靠前的化合物可能是熟地黃-山茱萸發(fā)揮治療DKD作用的關鍵成分。

通過STRING數(shù)據(jù)庫獲得PPI網絡信息提示，熟地黃-山茱萸干預DKD的關鍵靶點涉及AKT1、CASP3、VEGFA、TP53、PPARG、JUN等。研究表明，鏈脲作菌素誘導的糖尿病腎病模型小鼠使用CASP3抑制劑(Z-DEVD-FMK)8周后，DKD小鼠的蛋白尿、腎小管間質纖維化以及腎功能可得到有效改善[34]。因此，推測熟地黃-山茱萸可能通過抑制CASP3的信號通路，實現(xiàn)減少腎細胞凋亡，保存殘余腎單位，達到保護腎功能的作用。研究表明，VEGFA是糖尿病腎病血管功能障礙的關鍵因子，能夠保護血管內皮細胞，預防DKD腎功能損害和組織學改變[35]。VEGFA通過減少腎小球基底膜陰離子數(shù)量，干預腎小球內皮細胞小窗形成，進而影響腎小球基底膜電荷屏障和機械屏障，使腎小球濾過膜對血漿蛋白的通透性增加，導致蛋白尿的形成[36]。AKT1能夠調控細胞增殖、遷移、凋亡等多種生物過程，能夠調控葡萄糖的攝取[37]。研究表明，調節(jié) AKT1能夠修復腎小管上皮細胞，從而減輕細胞凋亡和炎癥反應，保護腎功能[38]。PPARG能夠調節(jié)全身的脂質代謝，參與脂肪細胞分化和維持葡萄糖水平，與糖尿病、肥胖、心血管疾病密切相關[39]。

GO功能富集分析結果表明，熟地黃-山茱萸防治DKD涉及多個生物學過程，主要集中于藥物反應、雌二醇反應、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控、一氧化碳生物合成的正調控、凋亡過程的負調控等。KEGG通路富集分析顯示，熟地黃-山茱萸干預DKD的信號通路主要包括HIF-1信號通路、細胞凋亡信號通路、p53信號通路、PI3K-Akt信號通路、T細胞受體信號通路等。HIF-1α是HIF-1信號通路上的關鍵靶點，抑制HIF-1α的釋放能減輕高糖培養(yǎng)大鼠模型的腎小球系膜細胞的炎癥及纖維化[40]。HIF-1信號通路能調節(jié)VEGFA，進而修復腎組織微小血管損傷，最終改善腎臟缺血缺氧的狀態(tài)，達到延緩腎纖維化的目的，實現(xiàn)保護腎功能的作用[41]。PI3K-Akt信號通路具有調節(jié)細胞增殖、凋亡與自噬的重要作用。研究表明，PI3K-Akt信號通路能夠調控足細胞的凋亡，而足細胞具有維持正常腎小球濾過膜形態(tài)和功能的作用，通過抑制足細胞的凋亡可能實現(xiàn)抑制腎小球硬化以及腎間質纖維化，達到減少蛋白尿，保護腎功能的目的[42]。HIF與P13K/AKT等信號通路相互作用，能夠共同參與腎纖維化的調節(jié)。研究表明，通過調節(jié)p53信號通路，可能抑制高糖誘導足細胞的損傷與凋亡，從而起到延緩DKD病程進展的作用[43]。

綜上，本研究基于網絡藥理學的方法，探討了熟地黃-山茱萸防治DKD的作用機制及活性成分發(fā)揮作用的藥效物質基礎，結果表明，熟地黃-山茱萸治療DKD的潛在活性成分有β-谷甾醇、豆甾醇、漢防己甲素、沒食子酸等，核心靶點有AKT1、CASP3、VEGFA、TP53、PPARG、JUN等，通過調節(jié)HIF-1信號通路、細胞凋亡信號通路、p53信號通路、PI3K-Akt信號通路、T細胞受體信號通路等干預DKD，并利用分子對接技術對潛在成分與關鍵靶點的相互作用能力進行驗證。在網絡藥理學研究中，由于活性成分篩選的標準不一，預測靶點的方法不同，數(shù)據(jù)搜集是否全面等，都會對結果產生影響。本研究是以TCMSP數(shù)據(jù)庫用戶指南2021年更新的建議進行熟地黃-山茱萸活性成分的篩選，但未考慮藥物的劑量以及煎煮等問題。因此，預測的結果仍需通過相應的藥效機制實驗進行驗證。