馬 宇，楊證玉，何寶紅，毛家敏，曾迎春△

1.成都醫(yī)學院 藥學院(成都 610500)；2.成都醫(yī)學院 結(jié)構(gòu)特異性小分子藥物研究四川省高校重點實驗室(成都 610500)

東莨菪內(nèi)酯(7-羥基-6-甲氧基香豆素，Scopoletin，Sco)屬于一種香豆素類化合物，在植物中分布廣泛，具有多種藥理活性[1]。研究[2]表明，Sco既可抑制高尿酸血癥模型小鼠肝臟中尿酸的產(chǎn)生，又能促進腎臟對尿酸的排泄，顯示出良好的抗痛風潛能。由于Sco溶解性差且在體內(nèi)易被代謝，口服生物利用度低(約6%)[3]，限制了該藥的成藥性。為提高Sco的口服生物利用度，筆者在前期研究[4-5]中，利用制劑手段，以聚乙烯己內(nèi)酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇(Soluplus)為載體材料，成功制備了Sco-Soluplus口服膠束給藥系統(tǒng)(Sco micelles，Sco-Ms)，并對其進行了體內(nèi)外表征，結(jié)果表明，Sco-Ms提高了Sco的口服吸收和體內(nèi)組織分布濃度，增強了Sco的體內(nèi)抗痛風療效。本實驗擬建立測定灌流樣品中Sco含量的高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)法，通過在體原位胃灌注模型以及在體單向腸灌流模型，考察Sco及Sco-Ms在胃腸道中的吸收情況，為Sco口服給藥系統(tǒng)的開發(fā)奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑和動物

1260 infinity液相色譜系統(tǒng)、G1329B自動進樣器、G1311C四元泵、G1314C紫外檢測器、Kromasil C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)(美國安捷倫)；HL-1S型恒流泵(上海青浦滬西儀器廠)；BS 110S型電子分析天平(德國Sartorius)；R-144型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi)；Allegra X-22R臺式高速冷凍離心機(美國Beckman-Coulter)。

Sco(純度>98%，成都瑾哲生物科技有限公司)；Soluplus(德國BASF)；BCA蛋白定量檢測試劑盒(武漢博士德生物科技有限公司)；胃蛋白酶(上海明豐生物科技有限公司)；戊巴比妥鈉(上海紀寧實業(yè)有限公司)；人工胃液及Krebs-Ringers溶液(參照藥典配制)；乙腈和甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純以上，水為純水或超純水。

SPF級雄性SD大鼠53只,體重(200±20)g，四川大學實驗動物中心提供[動物許可證號:SYXK(川)2018-026]，自由攝食、飲水，于室溫條件下飼養(yǎng)7 d后開始實驗。

1.2 方法

1.2.1 Sco-Ms的制備 Sco-Ms 按參考文獻[4]方法，將質(zhì)量比為1∶15的Sco與Soluplus溶于二氯甲烷中，超聲均勻分散，真空減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑，形成一層透明薄膜。再用一定量的分散介質(zhì)溶解稀釋，即得澄清透明的Sco-Ms溶液。

1.2.2 Sco在體胃腸樣品的HPLC分析方法建立1)色譜條件：采用美國安捷倫1260 infinity液相色譜系統(tǒng)測定樣品中Sco的含量。流動相：0.1%磷酸水溶液∶乙腈=7∶3；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：346 nm；進樣量：20 μL。2)標準樣品處理方法：精密吸取一定濃度的Sco甲醇標準工作液，置于1.5 mL離心管中，加入100 μL水和200 μL甲醇，渦旋3 min，13 000 r/min,離心10 min(離心半徑6 cm)，取上清液20 μL于上述色譜條件下進樣，記錄色譜峰面積。3)待測樣品處理方法：精密吸取100 μL待測樣品，加入300 μL甲醇，渦旋3 min，13 000 r/min,離心10 min(離心半徑6 cm)，取上清液20 μL進樣，記錄色譜峰面積。4)專屬性考察：取空白材料的甲醇溶液、空白胃液、空白Krebs-Ringer緩沖液、Sco的甲醇溶液和在體胃腸實驗后的Sco樣品，按1)項下HPLC條件進樣，考察空白材料、空白胃液、Krebs-Ringer 緩沖液和胃腸樣品的內(nèi)源性成分是否干擾Sco的檢測。5)標準曲線制備：精密吸取一定量的Sco甲醇溶液儲備液，用甲醇逐級稀釋配制成濃度分別為0.51、1.02、2.03、5.08、10.16、20.32、50.80、101.60、203.20 mg/L的Sco標準工作液。按照2)項下樣品處理方法處理后，按HPLC測定方法進樣測定，記錄峰面積。以Sco的色譜峰面積(A)對藥物濃度(C)進行線性回歸，得到標準曲線的回歸方程。6)回收率、精密度實驗：精密吸取一定量的Sco甲醇標準儲備液，用甲醇稀釋并制備成低、中、高濃度分別為0.61、10.16、162.56 mg/L的Sco標準樣品。取上述標準樣品，按色譜條件分別進樣5次并記錄峰面積，根據(jù)5)項下回歸方程計算Sco的濃度，計算回收率。另取上述標準樣品溶液，分別于1 d內(nèi)連續(xù)進樣5次和連續(xù)5 d各進樣1次，測定峰面積，計算日內(nèi)、日間精密度。

1.2.3 Sco在大鼠胃腸黏膜勻漿液中的穩(wěn)定性實驗 參照文獻[6-7]方法，取禁食過夜但自由飲水的大鼠3只，斷頸處死。分別收集每只大鼠的胃及各腸段黏膜，采用冰冷生理鹽水勻漿，于4 ℃,5 000 r/min,離心10 min(離心半徑6 cm)，離心后取上清液重復離心1次，將上清液中蛋白濃度稀釋至1 g/L備用。在稀釋液中加入適量Sco溶液(最終濃度為10 mg/L，n=3)，于37 ℃水浴鍋中孵育2 h，采用上述HPLC法測定孵育前后樣品中Sco的含量。

1.2.4 在體原位胃灌注實驗 參照文獻[8-9]方法，取禁食過夜但自由飲水的大鼠10只，隨機分為Sco組和Sco-Ms組，每組5只，腹腔注射45 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉。仰臥位固定，沿腹中線剪開腹腔，暴露胃部，分別在幽門及賁門切口并插管。用37 ℃生理鹽水沖洗胃內(nèi)容物，并用空氣排空，結(jié)扎賁門。將2 mL含藥人工胃液(200 mg/L)注入胃中，結(jié)扎幽門。將胃放回腹腔，切口處用浸有37 ℃生理鹽水的紗布覆蓋。2 h后抽取胃內(nèi)溶液，并用人工胃液沖洗胃內(nèi)2次，合并兩液定容至10 mL，測定藥物濃度(n=5)。

1.2.5 在體單向腸灌流實驗 參照文獻[8-9]方法，取禁食過夜但自由飲水大鼠40只，隨機分為Sco組和Sco-Ms組，每組20只，每個腸段各5只，腹腔注射45 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉。仰臥位固定，沿腹中線剪開腹腔，選擇相應腸段于上、下兩端切口，用37 ℃生理鹽水沖洗內(nèi)容物，排空后下端切口結(jié)扎，腹部切口處用浸有37 ℃生理鹽水的紗布覆蓋。以0.3 mL/min速度,用37 ℃空白Krebs-Ringer緩沖液平衡20 min，排空后將37 ℃恒溫供試液(200 mg/L Sco或Sco-Ms)全速泵入整截腸道，再將流速調(diào)至0.2 mL/min,平衡20 min后，于進口處用裝有供試液的EP管進行灌流，出口處用EP管收集流出液。每次收集10 min，1 h內(nèi)共收集6次。實驗結(jié)束，后測量各腸段長度(l)和內(nèi)徑(r)，按下式計算Sco的表觀滲透系數(shù)Papp和吸收速率常數(shù)Ka(n=5)：

Cin和Cout分別為供試液及流出液的濃度，Vin和Vout分別為灌入供試液及流出液的體積，Q為腸灌流速度。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 Sco含量測定方法的建立

2.1.1 專屬性 Sco的保留時間約為4.6 min，無雜質(zhì)或內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，專屬性良好，說明該色譜條件下可對Sco進行專屬性檢測(圖1)。

圖1 HPLC色譜圖

2.1.2 標準曲線 實驗色譜條件下，峰面積(A)與Sco藥物濃度(C)之間有良好的線性關(guān)系(r=0.999 9)，在0.51～203.20 mg/L濃度范圍內(nèi)，標準方程為A=13.823C-1.304。

2.1.3 回收率和精密度 按“1.2.2”項下所述方法進行回收率與精密度實驗，Sco回收率為99.3%～101.3%(表1)，日內(nèi)和日間精密度在0.6%～3.9%(表2)，以上結(jié)果說明該HPLC法符合日常含量測定要求。

表1 回收率實驗結(jié)果

表2 精密度實驗結(jié)果

2.2 Sco在大鼠胃腸黏膜勻漿液中的穩(wěn)定性

按“1.2.3”項所示方法測定Sco在大鼠胃腸黏膜勻漿液中的穩(wěn)定性。孵育2 h后，各組樣品中Sco的減少比例均在5%以內(nèi)，Sco在胃腸壁黏膜勻漿液中較為穩(wěn)定(表3)。

表3 Sco在胃腸道黏膜勻漿液中的穩(wěn)定性

2.3 在體原位胃灌注吸收結(jié)果

在胃中灌注2 h后，Sco和Sco-Ms的胃吸收百分率分別為(70.31±4.34)%和(75.93±4.10)%。與Sco組相比，Sco-Ms組在胃中的吸收率并沒有明顯提高(表4)。

表4 Sco和Sco-Ms的胃吸收百分率

2.4 在體單向腸灌流各腸段吸收參數(shù)

Sco在各腸段的Papp和Ka值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，均表現(xiàn)出良好的吸收；與Sco原料藥相比，Sco-Ms在十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸的Papp和Ka值均增加明顯(P<0.05)，表明Sco-Ms可有效提高Sco在各腸段的滲透性(圖2)。

圖2 Sco和Sco-Ms在不同腸段的吸收參數(shù)

3 討論

目前研究藥物胃腸吸收機制的常用方法包括離體腸囊外翻法、在體腸灌流法和細胞模型法等，研究者們[10-12]證實了這些吸收模型和人體吸收具有良好的相關(guān)性。離體腸囊外翻法實驗過程中需要翻轉(zhuǎn)小腸，容易造成小腸形態(tài)學的破壞，致使結(jié)果出現(xiàn)較大偏差，且由于缺乏營養(yǎng)供應，組織易壞死[13]。Caco-2細胞模型對供試樣品的要求較高，能較好地模擬體內(nèi)腸道組織，與整體吸收具有良好的相關(guān)性，但不能代替整體動物實驗[14]。在體腸灌流模型中,灌流器官基本完整，最接近于體內(nèi)狀態(tài)[15];流出液易收集，可避免因體內(nèi)藥物分配、消除所帶來的影響，專注于吸收研究。在體小腸灌流又可分為小腸循環(huán)灌流法和小腸單向灌流法，對于吸收速率常數(shù)較小的藥物，小腸循環(huán)灌流可能造成較大誤差[16]。因此，本研究選擇小腸單向灌流法來研究Sco和Sco-Ms的吸收部位和吸收動力學特性。小腸吸收藥物的同時也會吸收一部分水分，從而引起腸灌流液體積的變化。本實驗采用重量法校正流入與流出灌流液的體積，以消除因腸段吸收水分帶來的影響[17]。

胃腸道中具有多種酶類，有的藥物可能會在胃腸道內(nèi)被代謝，使藥物在消化道中減少速率增加，從而計算得到Papp值偏高[18]。前期研究[19]發(fā)現(xiàn),Sco存在嚴重的首過效應[3]，進入Caco-2細胞后可被迅速代謝。本研究旨在考察藥物在胃腸道黏膜勻漿液中的穩(wěn)定性及Sco在體內(nèi)參與的代謝過程，以便對Sco和Sco-Ms的滲透性和部位吸收特異性作出正確判斷。本實驗結(jié)果表明，Sco在胃腸道黏膜中穩(wěn)定性良好，將代謝實驗中蛋白濃度加大依然出現(xiàn)相似結(jié)果。同等實驗條件下，桑色素則可在腸黏膜中發(fā)生不同程度的降解[20]。因此，認為Sco體內(nèi)代謝相關(guān)的關(guān)鍵酶在胞內(nèi)而非腸腔。

本研究在體原位胃灌注實驗表明，Sco原料藥在胃中的吸收良好，灌注2 h后，Sco在體內(nèi)的吸收率可達70.31%,Sco-Ms的吸收率為75.93%，二者間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。這可能與Sco在胃中全部以分子形式存在，利于其跨膜吸收有關(guān)。

Sco在十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸的Papp分別為(8.48±1.03)×10-3cm/min、(8.44±1.17)×10-3cm/min、(8.05±1.15)×10-3cm/min和(7.17±1.18)×10-3cm/min，相互間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，所以在體腸灌流實驗結(jié)果顯示,Sco沒有特異性吸收部位。研究[21]顯示，當藥物Papp>1.2×10-3cm/min時，表示其容易被吸收。Sco在各腸段的表觀滲透系Papp均>1.2×10-3cm/min，表明Sco較易被腸道吸收。相較于Sco，Sco-Ms可進一步提高其在各腸段的Papp和Ka值。以上結(jié)果說明，口服后，Sco-Ms除了增加Sco在胃腸道中的溶解度外，還可進一步提高Sco在整個腸道中的滲透性，從而提高Sco的口服吸收率。

綜上所述，Sco在胃腸道黏膜中較為穩(wěn)定，Sco-Ms膠束系統(tǒng)能有效促進Sco在整個腸段的吸收，進而提高Sco的口服生物利用度。本研究將為Sco口服遞藥系統(tǒng)的設(shè)計提供參考依據(jù)，促進Sco的開發(fā)和利用。在將來的工作中，擬考察Sco-Ms在細胞水平上的攝取和轉(zhuǎn)運，更加深入闡明其促吸收機制。