張 敏，徐 娜，李星星,張 雪，何 霞△

1.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 藥劑科(成都 610071)；2.成都中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院(成都 611137)；3.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院 藥學(xué)部(成都 610072)；4.電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院·個(gè)體化藥物治療四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(成都 610072)

肺結(jié)核是一種慢性呼吸道傳染疾病，研究[1]數(shù)據(jù)顯示，全球每年死于肺結(jié)核的人數(shù)高達(dá)200萬(wàn)人，我國(guó)每年新增肺結(jié)核患者約100萬(wàn)人，且全球患病率呈逐年上升趨勢(shì)，肺結(jié)核已成為嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的傳染病之一。相關(guān)研究[2]報(bào)道，抗結(jié)核藥物不良反應(yīng)中肝損傷可達(dá)5.17%(60/1 160)，肝損傷不僅影響結(jié)核患者治療持續(xù)性和藥物療效，甚至?xí)＜盎颊呱，F(xiàn)有研究[3]表明，應(yīng)用常用的一線抗結(jié)核藥物聯(lián)合治療的患者相較于其他抗結(jié)核治療方案的患者，被診斷為肝損傷的概率更高。常用一線抗結(jié)核藥物主要有吡嗪酰胺(pyrazinamide，PZA)、利福平(rifampicin，RFP)、異煙肼(isoniazid，INH)、乙胺丁醇(ethambuto，EMB)等，其中PZA、RFP和INH均具有肝臟毒性[4]。當(dāng)肺結(jié)核患者治療過(guò)程中出現(xiàn)肝功能異常時(shí)可影響治療效果，甚至中斷治療、產(chǎn)生耐藥性[5]。因此，在治療肺結(jié)核患者的標(biāo)準(zhǔn)方案實(shí)施時(shí)，盡量減輕或避免肝損傷的發(fā)生對(duì)于提高抗結(jié)核藥物臨床療效和改善患者預(yù)后具有重要意義。N-乙?；D(zhuǎn)移酶2(N-acetyltransferase 2，NAT2)是人體內(nèi)重要的Ⅱ相代謝酶，為INH、RFP的代謝酶，其基因的多態(tài)性與患者肝損傷、結(jié)核治療藥物代謝形式間存在聯(lián)系[6]。由于NAT2基因多態(tài)性導(dǎo)致乙?；芰Φ牟煌?，可分為慢乙?；?slow acetylator，SA)、中乙?；?intermediate acetylator，IA)和快乙?；?rapid acetylator，RA)[7]。近年越來(lái)越多研究[8-9]表明，NAT2基因多態(tài)性與抗結(jié)核藥物性肝損傷(druginduced liver injury during anti-TB treatment,AT-DILI)易感性存在密切聯(lián)系。本研究旨在分析經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)治療方案治療后，患者抗結(jié)核藥物血藥濃度與NAT2基因多態(tài)性間的相關(guān)性，為后續(xù)進(jìn)一步研究NAT2基因多態(tài)性與AT-DILI相關(guān)性提供更多的臨床基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

納入2019年1月至2021年6月于四川省人民醫(yī)院和成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院診斷為肺結(jié)核的住院患者55例為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：1)根據(jù)痰涂片陽(yáng)性、痰培養(yǎng)陽(yáng)性、病理學(xué)報(bào)告陽(yáng)性和臨床診斷確診的結(jié)核患者或《抗結(jié)核藥物性肝損傷診治指南(2019年版)》[10]確診為肺結(jié)核的患者；2)年齡16～85歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：1)不使用INH、PZA等一線抗結(jié)核藥物標(biāo)準(zhǔn)治療方案的患者；2)不能獲取患者抗結(jié)核藥物前后完整相關(guān)生化指標(biāo)數(shù)據(jù)的病例；3)入組前肝功能異?；蚝喜⒒疾《拘愿窝?、脂肪肝等對(duì)肝功能影響較大的患者；4)服用化療藥物、部分抗菌藥物、大劑量對(duì)乙酰氨基酚等有明顯肝毒性藥物患者[11]。

研究在四川省人民醫(yī)院和成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)下進(jìn)行。根據(jù)乙?；芰Φ牟煌?，55例患者被分為RA組19例(34.5%)、IA組29例(52.7%)和SA組7例(12.7%)；其中男39例(70.9%)，女16例(29.1%)；漢族52例(94.5%)，藏族2例(3.6%)，羌族1例(1.8%)；年齡17～84歲，體重37～75 kg，體重指數(shù)(body mass index,BMI)15.37～26.22 kg/m2；血藥濃度:INH 0.25～2.11 mg/L，RFP 0.25～19.79 mg/L，PZA 1.00～51.81 mg/L。

1.2 觀察指標(biāo)

基本信息：患者性別、年齡、疾病診斷、體重、民族、開(kāi)始抗結(jié)核治療日期、吸煙史、飲酒史、既往史、抗結(jié)核治療藥物及其劑量。檢測(cè)與肝毒性有關(guān)的INH、RFP和PZA藥物血藥濃度[12]。

1.3 給藥方案

采用世界衛(wèi)生組織推薦標(biāo)準(zhǔn)治療方案：INH、RFP、PZA和EMB 2個(gè)月強(qiáng)化治療；INH+RFP 4個(gè)月鞏固治療[10,13]。

1.4 檢測(cè)方法

在接受抗結(jié)核治療前,應(yīng)用熒光定量PCR探針?lè)y(cè)定NAT2基因6個(gè)位點(diǎn)(rs1799929、rs1799930、rs1041983、rs1799931、rs1208、rs1801280)的基因型。應(yīng)用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(ultra performance liquid chromatography-MS/MS，UPLC-MS/MS)測(cè)定抗結(jié)核治療開(kāi)始后7 d患者的抗結(jié)核藥物濃度，分析NAT2基因多態(tài)性與標(biāo)準(zhǔn)方案治療后抗結(jié)核藥物血藥濃度間的關(guān)系。DNA的提取、保存按照DNA提取試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，應(yīng)用NAT2Taqman SNP 基因分型試劑盒檢測(cè)NAT2基因位點(diǎn)。反應(yīng)條件：60 ℃ 20 s，95 ℃ 5 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 60 s，共40個(gè)循環(huán)；60 ℃延伸5 min，詳見(jiàn)參考文獻(xiàn)[14]。

1.5 藥品、試劑與儀器

藥品：PZA(100 mg/支,批號(hào)：100178-201104)，RFP(100 mg/支,批號(hào)：130496-201403)，INH(100 mg/支,批號(hào)：100578-200401)，均來(lái)源于中國(guó)食品藥品檢定研究院[11]。試劑：血液基因組離心柱型DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)；NAT2Taqman SNP 基因分型試劑盒(美國(guó)AppliedBiosystem公司)；NAT2基因分型試劑盒(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)。儀器：NanoDrop 2000型核酸濃度測(cè)定儀、實(shí)時(shí)定量PCR儀ABI7500(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；NAT2primer(美國(guó) Invitrogen公司)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀LightCycler?480 Ⅱ(德國(guó)Roche公司)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 3組患者一般資料比較

RA組、IA組和SA組3組患者性別、年齡、體重和BMI一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性(表1)。

表1 3組患者一般資料比較

2.2 NAT2基因多態(tài)性位點(diǎn)分型結(jié)果

55例患者檢測(cè)NAT2 6種基因型:NAT2*4*4、NAT2*4*6A、NAT2*4*7B、NAT2*4*5B、NAT2*6A*7B和NAT2*6A*6A，基因型分布分別為34.5%、32.7%、18.2%、1.8%、7.3%和5.5%(表2)。

表2 3組患者NAT2基因型分析結(jié)果[n(%)]

2.3 NAT2基因位點(diǎn)HWE遺傳平衡檢驗(yàn)

應(yīng)用χ2檢驗(yàn)對(duì)NAT2基因6個(gè)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)位點(diǎn)的基因型分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，6個(gè)SNPs基因型在患者人群中的分布均符合HWE，所選研究對(duì)象具有代表性(P>0.05)(表3)。

表3 患者NAT2基因型Hardy-weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)結(jié)果

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 精密度實(shí)驗(yàn) 對(duì)PZA、INH和RFP進(jìn)行低、中、高濃度(PZA 4.0、20.0、160.0 mg/L；INH和RFP 1.0、5.0、40.0 mg/L)的精密度實(shí)驗(yàn)，批內(nèi)、批間精密度CV值≤15%滿(mǎn)足要求。

2.4.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 對(duì)PZA、INH和RFP進(jìn)行低、中、高濃度(PZA 4.0、20.0、160.0 mg/L；INH和RFP 1.0、5.0、40.0 mg/L)室溫、-80 ℃的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，PZA、INH和RFP在室溫下存放2、4、8 h的相對(duì)偏差均<15%，各目標(biāo)物在室溫下可維持8 h的穩(wěn)定性，三者在-80 ℃下3次凍融檢測(cè)結(jié)果仍穩(wěn)定。

2.5 3組NAT2基因型間血藥濃度比較

NAT2基因型4*4組、4*5B組、4*6A組、4*7B組、6A*6A組及6A*7B組與PZA、INH、RFP血藥濃度間相關(guān)系數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，不存在相關(guān)關(guān)系(表4)。

表4 3組NAT2基因型間血藥濃度比較[mg/L,M(P25，P75)]

2.6 3組NAT2基因各乙酰化類(lèi)型間血藥濃度比較

NAT2基因不同乙?；?lèi)型:RA組、IA組、SA組與PZA、INH、RFP血藥濃度間相關(guān)系數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，不存在相關(guān)關(guān)系(表5)。

表5 3組NAT2基因不同乙?；?lèi)型的血藥濃度比較[mg/L,M(P25，P75)]

3 討論

NAT2在肝臟中參與了INH、RFP等抗結(jié)核藥物的代謝[16]，其乙?；饔檬荌NH不同代謝途徑中最重要的途徑[17]。由于NAT2基因多態(tài)性造成的乙?；芰Σ煌?，RA型較SA型轉(zhuǎn)化INH為乙酰肼的速度更快，使具有肝毒性的乙酰肼不易蓄積，解毒效率增加，在SA型患者中乙酰肼生成無(wú)毒物質(zhì)的過(guò)程可能受阻，最終生成具有肝臟損害作用的毒性物質(zhì)[18],因而導(dǎo)致INH藥代動(dòng)力學(xué)的個(gè)體化差異。此外，研究[19-20]表明，RFP與INH聯(lián)合用藥時(shí)，雖用藥時(shí)間越久藥物療效越高，但肝損傷發(fā)生率越高、造成的肝臟損害也越大。王金河等[21]研究表明，攜帶SA型基因型的結(jié)核患者在經(jīng)INH和RFP治療后發(fā)生肝功能異常的可能性更高。因此，RFP與INH合用所引發(fā)的肝臟毒性與NAT2基因多態(tài)性間密切相關(guān)。

目前，國(guó)內(nèi)外已有關(guān)于NAT2基因多態(tài)性與抗結(jié)核藥物血藥濃度及AT-DILI關(guān)系的研究。劉誠(chéng)誠(chéng)等[22]研究表明，相對(duì)于RA型和IA型，SA型INH濃度最高，且易導(dǎo)致患者發(fā)生肝損傷。許飛虹[23]報(bào)道，RA型和SA型患者INH藥物血漿濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Singh等[24]報(bào)道55例印度結(jié)核病患者服用INH 1、2 h后的藥物血漿濃度結(jié)果顯示,RA型、IA型和SA型之間血漿濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。上述研究說(shuō)明NAT2基因型與INH血藥濃度具有一定相關(guān)性。Chen等[25]采用反向斑點(diǎn)雜交法測(cè)定NAT2基因型，柱前衍生化高效液相色譜法檢測(cè)藥物血藥濃度實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NAT2基因RA型、IA型與SA型PZA、INH和RFP血藥濃度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，暫不能說(shuō)明二者具有相關(guān)性。導(dǎo)致上述結(jié)論不一致的原因可能有：研究所針對(duì)的群體不同。研究[26-27]表明，NAT2基因多態(tài)性在不同民族、種族間分布有明顯差異，患者所采用的抗結(jié)核治療方案有所差異，研究對(duì)象納、排標(biāo)準(zhǔn)存在差異等。

本研究采用熒光定量PCR探針?lè)y(cè)定NAT2基因的基因型，應(yīng)用UPLC-MS/MS法測(cè)定患者的抗結(jié)核藥物血藥濃度。數(shù)據(jù)分析顯示，NAT2基因RA型、IA型、SA型與INH血藥濃度間相關(guān)關(guān)系比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，這一結(jié)果與國(guó)內(nèi)外大多數(shù)研究結(jié)論不一致，但仍有研究結(jié)論與本研究結(jié)論一致，因此二者有無(wú)關(guān)聯(lián)性的結(jié)論仍需進(jìn)一步深入研究。此外，3種基因型間RFP、PZA的血藥濃度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，推測(cè)NAT2基因多態(tài)性并非RFP和PZA血藥濃度的主要影響因素。但本研究存在一定局限性：1)樣本量太少，這可能是造成研究結(jié)果出現(xiàn)偏差的主要原因；2)藥物血藥濃度的變化受多個(gè)因素的影響，但本研究?jī)H探討了NAT2基因多態(tài)性與INH、RFP和PZA血藥濃度的單因素；3)藏族群體樣本量不足，無(wú)法進(jìn)行不同民族間的研究。因此，在后續(xù)的研究中應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，對(duì)不同民族、種族及更多的藥物血藥濃度影響因素，如患者體重、年齡、白蛋白水平和并發(fā)癥等[28-29]進(jìn)行討論，使研究更加科學(xué)、有效。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，NAT2基因多態(tài)性與INH、RFP和PZA可能均不存在直接關(guān)聯(lián)。因此，關(guān)于NAT2基因型與結(jié)核患者標(biāo)準(zhǔn)治療方案治療后藥物血藥濃度的關(guān)系，尚需進(jìn)一步研究探索，為肺結(jié)核患者的臨床個(gè)體化用藥治療提供參考。