劉寶峰，昝雙江，駱偉舜，韓 梅

(1.天津市第四中心醫(yī)院藥劑科 300140；2.天津市小淀社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心內(nèi)科 300251)

子癇前期(preeclampsia，PE)是特發(fā)于妊娠期的一種高血壓疾病，患者出現(xiàn)血壓升高、蛋白尿癥狀，且其肝、腎功能及胎盤功能發(fā)生障礙，極大威脅母嬰生命安全，亦是導(dǎo)致死胎、孕產(chǎn)婦死亡的重要原因[1-2]。胎盤缺血缺氧是PE的一個主要特征，可導(dǎo)致炎癥信號異常激活，促進(jìn)氧自由基大量釋放，最終引發(fā)母體全身氧化應(yīng)激及胎盤組織脂質(zhì)過氧化，造成母體高血壓及胎兒發(fā)育受限，減輕氧化應(yīng)激可有效防治PE[3-4]。腺苷酸活化蛋白激酶(adenylate-activated protein kinase，AMPK)是一種蛋白激酶，刺激其激活，可擴(kuò)張血管，恢復(fù)PE患者胎盤血流灌注，緩解其缺血缺氧癥狀，還可上調(diào)下游核孔糖蛋白62(p62)、核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor2，Nrf2)信號分子表達(dá)，增強(qiáng)機(jī)體自噬與抗氧化活性，減輕氧化應(yīng)激損傷，促進(jìn)胎兒生長發(fā)育，改善PE癥狀[5-7]，因而激活A(yù)MPK/p62/Nrf2信號是PE的一個有效治療手段。夏枯草是廣泛用于清熱消炎、軟堅散結(jié)、降火明目的一種常用中藥，而夏枯草提取物(prunella vulgaris extracts，PVE)具有明顯的清除自由基、消炎及抗氧化的功效，可增強(qiáng)抗氧化酶活性，減輕急性束縛誘發(fā)的小鼠氧化應(yīng)激損傷，還可降低血壓，改善老年高血壓患者各種臨床癥狀[8-9]，但PVE是否可用于治療PE及其對PE大鼠模型AMPK/p62/Nrf2通路的影響，目前尚未見確切報道，本文以不同劑量PVE干預(yù)處理PE模型大鼠，并對此進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物

SD大鼠150只(雌、雄各75只)，生產(chǎn)許可SCXK(滬)2018-0004，雌性180～220 g，雄性260～300 g，均來自上海杰思捷實驗動物有限公司，于天津市第四中心醫(yī)院動物中心的屏障系統(tǒng)適應(yīng)飼養(yǎng)，飼養(yǎng)房內(nèi)溫度22.5～25.5 ℃，相對濕度52%～57%，照明為12 h/12 h明暗循環(huán)光照，房內(nèi)保持噪音小、通氣良好。本研究通過天津市第四中心醫(yī)院倫理委員會審批。

1.1.2主要試劑與儀器

(1)試劑：左旋硝基精氨酸甲酯(L-nitro arginine methyl ester,L-NAME,貨號FT011014)購自上海梵態(tài)生物科技有限公司；夏枯草全草(批號20141005)購自西安天瑞生物技術(shù)有限公司；硫酸鎂(批號20180125)、放射免疫沉淀法(radio immunopreci pitation assay，RIPA)裂解液(貨號P0013B)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；活體組織活性氧(reactive oxygen species,ROS)測定試劑盒(貨號HL10016.4)購自上海哈靈生物科技有限公司；過氧化氫酶(catalase，CAT)活性測定試劑盒(貨號ab83464)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒(貨號ab238537)、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白檢測試劑盒(貨號ab102536)、兔源Anti-三磷酸甘油醛脫氫酶(glyceyaldehyde-3-phosp-hate dehydrogenase,GAPDH)一抗(貨號ab181602)、兔源Anti-AMPK一抗(貨號)、兔源Anti-p-AMPK一抗(貨號ab133448)、兔源Anti-p62一抗(貨號ab109012)、兔源Anti-Nrf2一抗(貨號ab31163)、羊抗兔二抗(ab150077)購自美國Abcam公司。(2)儀器：電子尾袖式血壓計(型號HD-QB52)購自美國IITC公司；自動生化分析儀(型號Au1000)購自日本Olympus公司；精密電子天平(型號MS-TS)購自瑞士梅特勒-托利多公司；酶標(biāo)儀(型號Power Wave XS)購自美國Bio-Tek公司；電泳儀(型號iniPROTEAN Tetra)購自美國Bio-Rad公司；一體式凝膠成像儀、轉(zhuǎn)印電泳儀(型號WD-9413D、DYCZ-40D)均購自北京六一生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1構(gòu)建PE模型大鼠及分組給藥

將雌、雄SD大鼠以1∶1比例合籠，次日早上檢查，發(fā)現(xiàn)陰栓即可得到孕鼠，最終獲取孕鼠72只，此時為妊娠1 d，取60只孕鼠于妊娠13 d皮下注射200 mg/kg[10]的L-NAME，每天注射1次，連續(xù)注射4次，然后測量大鼠血壓，若升高30 mm Hg及以上即表明PE模型構(gòu)建成功，將60只PE構(gòu)建成功大鼠分為模型組、PVE低劑量(6 mg/kg)組、PVE中劑量(12 mg/kg)組、PVE高劑量(24 mg/kg)組、硫酸鎂(30 mg/kg)組，每組12只。另取12只妊娠13 d大鼠皮下注射等劑量生理鹽水，作為對照組。將夏枯草全草剪碎后，加入10倍量的蒸餾水煮沸后過濾、濃縮，得到生藥濃度為1 g/mL的濃縮液，加入磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋，配制成濃度分別為0.6、1.2、2.4 mg/mL的藥液[11]，以PBS溶解硫酸鎂，配制成濃度為3 mg/mL的藥液[12]，各藥物干預(yù)組大鼠均以10 mL/kg的劑量灌胃給藥，模型組與對照組大鼠灌胃10 mL/kg的PBS干預(yù)，于妊娠16 d開始每天1次，持續(xù)至妊娠21 d。

1.2.2大鼠妊娠晚期血壓及24 h尿蛋白、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)水平測定

以血壓測試儀測量妊娠21 d大鼠收縮壓、舒張壓，并計算得出平均動脈壓(mean arterial pressure，MAP)。以代謝籠收集妊娠21 d大鼠24 h內(nèi)尿液，取少量尾靜脈血，采用全自動生化分析儀測量24 h尿液中尿蛋白及尾靜脈血中BUN水平。

1.2.3大鼠妊娠結(jié)局情況及標(biāo)本收集

將妊娠21 d大鼠置于乙醚氣體中麻醉，開腹，取出胎鼠，計數(shù)后，測量其體重，得到每組孕鼠平均子代數(shù)目與平均子代體重；然后找到胎盤，分離出后剪下約0.8 g，加入RIPA裂解液，剪碎后勻漿、離心，收集上清液獲得蛋白樣品液，通過BCA法進(jìn)行蛋白定量后保存在-80 ℃冰箱中備用。

1.2.4大鼠胎盤組織ROS、CAT、MDA水平測定

取出1.2.3中的胎盤組織蛋白樣品液，提前放入4 ℃冰箱中，解凍后每組各取0.15 mL，參照各自試劑盒說明書指導(dǎo)步驟測定其中ROS、CAT、MDA水平。

1.2.5Western blot檢測大鼠胎盤組織Nrf2/血紅素氧合酶-1(hemeoxygenase-1，HO-1)/醌氧化還原酶1(quinone oxidoreductase-1，NQO1)通路蛋白水平

取1.2.4中剩余的蛋白樣品液，每組均上樣20 μg總蛋白，經(jīng)電泳后通過濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜，以3%牛血清白蛋白封閉液孵育1.5 h后，以均稀釋2 000倍的一抗溶液4 ℃條件下處理9 h，漂洗后以稀釋1 000倍的二抗溶液室溫處理1.5 h，以化學(xué)發(fā)光試劑顯色，在凝膠成像儀中成像，通過Image J軟件對圖像中各蛋白條帶完成灰度定量，使用GAPDH作內(nèi)參，對目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值比值進(jìn)行統(tǒng)計分析，即可得到各個蛋白的相對表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠妊娠晚期MAP、24 h尿蛋白及BUN水平比較

與對照組比較，模型組大鼠妊娠晚期MAP、24 h尿蛋白及BUN水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，PVE低、中、高劑量組及硫酸鎂組大鼠妊娠晚期MAP、24 h尿蛋白及BUN水平均降低(P<0.05)，且PVE各組呈劑量依賴性(P<0.05)；與硫酸鎂組比較，PVE高劑量組大鼠妊娠晚期MAP、24 h尿蛋白及BUN水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組大鼠妊娠晚期MAP、24 h尿蛋白及BUN水平比較

2.2 PVE對PE大鼠妊娠結(jié)局情況的影響

與對照組比較，模型組大鼠妊娠晚期平均子代數(shù)目、平均子代體重明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，PVE低、中、高劑量組及硫酸鎂組大鼠妊娠晚期平均子代數(shù)目、平均子代體重均升高(P<0.05)，且PVE各組呈劑量依賴性(P<0.05)；與硫酸鎂組比較，PVE高劑量組大鼠妊娠晚期平均子代數(shù)目、平均子代體重差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 各組大鼠妊娠晚期平均子代數(shù)目、平均子代體重比較

2.3 PVE對PE大鼠胎盤組織ROS水平的影響

與對照組比較，模型組大鼠胎盤組織ROS、MDA水平明顯升高，CAT水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，PVE低、中、高劑量組及硫酸鎂組大鼠胎盤組織ROS、MDA水平均降低，CAT水平均升高，且PVE各組呈劑量依賴性，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與硫酸鎂組比較，PVE高劑量組大鼠胎盤組織ROS、MDA、CAT水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 各組大鼠胎盤組織ROS、CAT等水平比較

2.4 PVE對PE大鼠胎盤組織AMPK/p62/Nrf2通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與對照組比較，模型組大鼠胎盤組織p-AMPK/AMPK、p62及Nrf2蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，PVE低、中、高劑量組及硫酸鎂組大鼠胎盤組織p-AMPK/AMPK、p62及Nrf2蛋白表達(dá)水平均升高(P<0.05)，且PVE各組呈劑量依賴性(P<0.05)；與硫酸鎂組比較，PVE高劑量組大鼠胎盤組織p-AMPK/AMPK、p62及Nrf2蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖1、表4。

A：對照組；B：模型組；C：PVE低劑量組；D：PVE中劑量組；E：PVE高劑量組；F：硫酸鎂組。

表4 各組大鼠胎盤組織p-AMPK/AMPK、p62及Nrf2蛋白相對表達(dá)水平比較

3 討 論

PE不僅可損害母體肝、腎功能，若病情未能有效控制，還可誘發(fā)腦出血、代謝紊亂、早產(chǎn)等各種并發(fā)癥，并明顯增加產(chǎn)婦及新生兒的死亡，雖然近年來醫(yī)療科技進(jìn)展迅速，但其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前仍無特別安全有效的防治措施，因而PE一直是學(xué)者亟待解決的臨床難點和熱點[13-14]。本文采用皮下注射L-NAME的方法誘導(dǎo)建立PE大鼠模型，結(jié)果顯示，L-NAME可誘導(dǎo)ROS大量產(chǎn)生釋放，引發(fā)嚴(yán)重的氧化應(yīng)激反應(yīng)，并導(dǎo)致孕鼠出現(xiàn)高血壓及蛋白尿癥狀，危害胎鼠生長發(fā)育，使大鼠平均子代數(shù)目及平均子代體重降低，妊娠晚期MAP、24 h尿蛋白及BUN水平升高。本研究結(jié)果顯示，皮下注射L-NAME可較全面準(zhǔn)確的模擬PE病理癥狀，本實驗?zāi)Ｐ蜆?gòu)建成功。

研究發(fā)現(xiàn)，PE患者機(jī)體抗氧化活性減弱，氧化應(yīng)激增強(qiáng)，降低氧自由基水平，可抑制氧化應(yīng)激發(fā)生及進(jìn)展，從而減輕胎盤組織損傷，改善PE癥狀[15-16]。夏枯草作為一種藥食同源植物，能清肝明目、降火祛瘀、散結(jié)消腫，在臨床中得到了廣泛應(yīng)用，不僅可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化引發(fā)的神經(jīng)炎癥，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，在臨床中通過抗炎及抗氧化活性而用于阿爾茨海默病、橋本甲狀腺炎等疾病的治療，還可明顯降低老年高血壓患者血壓，緩解其臨床癥狀[8-9,17-18]。鄧靜等[19]研究表明，夏枯草對酒精誘導(dǎo)的肝損傷大鼠具有很好的保護(hù)作用，因而可推測PVE可能對PE具有較好的治療作用。本實驗以不同劑量PVE干預(yù)處理PE模型大鼠，可降低胎盤組織ROS及MDA水平，升高胎盤組織CAT水平，減輕胎盤氧化應(yīng)激反應(yīng)，降低妊娠大鼠血壓，并改善大鼠蛋白尿癥狀，最終提高其平均子代數(shù)目及平均子代體重。本研究結(jié)果表明，PVE具有良好的抗氧化作用，能明顯抑制ROS產(chǎn)生釋放，增強(qiáng)PE大鼠抗氧化水平，降低胎盤氧化應(yīng)激損傷，保證胎鼠的正常生長發(fā)育，提升其生存率，且隨PVE劑量升高而作用增強(qiáng)。

AMPK/p62/Nrf2是機(jī)體調(diào)控氧化應(yīng)激、細(xì)胞代謝與凋亡的重要信號通路，廣泛參與介導(dǎo)PE的發(fā)病及病情進(jìn)展過程，刺激AMPK磷酸化，可促進(jìn)下游Nrf2、p62蛋白分子的表達(dá)，明顯抑制氧自由基的產(chǎn)生，增強(qiáng)組織細(xì)胞抗氧化活性，減輕過氧化氫誘導(dǎo)的滋養(yǎng)層細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，降低母體血壓，修復(fù)胎盤功能，保證胎兒正常發(fā)育生長，改善PE臨床癥狀[5-7,20-21]，因而，AMPK/p62/Nrf2信號可作為PE的一個重要治療靶點。本研究結(jié)果顯示，PE模型大鼠胎盤組織p-AMPK/AMPK、p62及Nrf2蛋白表達(dá)水平明顯降低，經(jīng)PVE干預(yù)處理后，其表達(dá)水平均升高，且呈劑量依賴性，表明AMPK/p62/Nrf2通路參與介導(dǎo)PE的病理過程，PVE可刺激其激活，減輕孕鼠氧化應(yīng)激損傷，促使胎鼠發(fā)育及存活，并改善PE癥狀。

綜上所述，PVE可增強(qiáng)AMPK磷酸化，上調(diào)p62及Nrf2蛋白表達(dá)，降低氧自由基水平，提升內(nèi)源性抗氧化活性，減輕PE大鼠胎盤組織氧化應(yīng)激損傷，降低其血壓，減輕蛋白尿癥狀，改善孕鼠胎盤功能，提升其子代生存率，減少不良妊娠結(jié)局發(fā)生，促進(jìn)AMPK/p62/Nrf2信號途徑傳導(dǎo)可能是其發(fā)揮上述藥理功效的分子機(jī)制。本研究證實了PVE對PE大鼠具有很好的治療作用，是本研究的創(chuàng)新點，為PE的臨床治療提供了新的候選藥物，但本文關(guān)于其藥理機(jī)制的研究還不全面，后續(xù)還會進(jìn)行回復(fù)實驗進(jìn)行深入研討。