曹俊杰，黃 劍，劉占鰲，霍桂軍，湯 堯

[南京醫(yī)科大學(xué)姑蘇學(xué)院/南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院/蘇州市立醫(yī)院(本部)血管外科，江蘇蘇州 215002]

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是心腦血管疾病的病理基礎(chǔ)，極大威脅人類(lèi)生命健康。血管內(nèi)皮細(xì)胞是維持血管壁結(jié)構(gòu)和功能的重要屏障，其損傷是AS發(fā)生的始動(dòng)環(huán)節(jié)[1]。因此，抑制或減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是預(yù)防和治療AS的重要途徑。環(huán)狀RNA(circRNA)是一類(lèi)非編碼RNA，可作為微RNA(microRNA，miRNA)分子海綿發(fā)揮作用，調(diào)控miRNA靶基因的表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞生理或病理過(guò)程，參與人類(lèi)多種疾病的發(fā)展進(jìn)程[2-4]。研究顯示，circ_0062389在心力衰竭大鼠心肌組織中高表達(dá)，沉默其表達(dá)可明顯降低大鼠心肌細(xì)胞凋亡，改善大鼠心肌功能，其作用機(jī)制與調(diào)控轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)/SMAD家族成員3(Smad3)信號(hào)通路有關(guān)，有可能成為治療心力衰竭的分子靶點(diǎn)[5]。但目前，circ_0062389對(duì)AS發(fā)生、發(fā)展的影響和機(jī)制還不清楚。Circular RNA Interactome靶基因在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè)顯示，circ_0062389可能競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA-331-3p。ZHANG等[6]研究顯示，脊髓損傷大鼠脊髓中miRNA-331-3p表達(dá)下調(diào)，miRNA-331-3p過(guò)表達(dá)可改善脊髓損傷大鼠運(yùn)動(dòng)能力，減輕脊髓組織損傷、神經(jīng)元凋亡和炎性反應(yīng)，可用作治療脊髓損傷的分子靶點(diǎn)。而目前miRNA-331-3p對(duì)AS發(fā)生、發(fā)展的影響還不清楚,因此，本研究通過(guò)建立氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，觀察circ_0062389和miRNA-331-3p對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的影響及circ_0062389可否通過(guò)調(diào)控miRNA-331-3p發(fā)揮作用，以期為AS的治療提供分子靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

細(xì)胞：人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)，購(gòu)自上海弘順生物科技有限公司。試劑：改良杜氏伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s Modified EagleMedium,DMEM)和膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-fluoresceinisothiocyanate/propidium iodide，Annexin V-FITC/PI)細(xì)胞凋亡試劑盒，購(gòu)自北京索萊寶公司；LipofectamineTM2000試劑盒，購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)，購(gòu)自浙江天杭州生物科技股份有限公司；circ_0062389小干擾RNA(si-circ_0062389)、小干擾RNA陰性序列(si-NC)、miRNA-331-3p抑制劑(anti-miRNA-331-3p)、抑制劑陰性序列(anti-miRNA-NC)、miRNA-331-3p 模擬物(mimics)、模擬對(duì)照序列(miRNA-NC)和聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)引物，均購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；RNA抽提試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒，購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)試劑盒，購(gòu)自南京建成生物工程研究所；兔抗人活化型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cleaved-caspase)3和cleaved-caspase9單克隆抗體，購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白檢測(cè)試劑盒和雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

復(fù)蘇HUVEC，用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)期HUVEC，將其接種至6孔板中(1.0×105個(gè)/孔)，培養(yǎng)12 h后棄培養(yǎng)液。采用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體法，分別轉(zhuǎn)染si-NC、si-circ_0062389、miRNA-NC、miRNA-331-3p mimics、共轉(zhuǎn)染si-circ_0062389與anti-miRNA-NC、si-circ_0062389與anti-miRNA-331-3p，轉(zhuǎn)染12 h后更換新鮮培養(yǎng)液，再培養(yǎng)24 h后，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)法檢測(cè)細(xì)胞中circ_0062389或miRNA-331-3p表達(dá)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果，并收集細(xì)胞備用。

1.2.2細(xì)胞分組處理

將未轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染后的HUVEC均接種至6孔板中(1.0×105個(gè)/孔)，培養(yǎng)12 h后棄培養(yǎng)液。未轉(zhuǎn)染的HUVEC分為對(duì)照組(Con組)和ox-LDL組，Con組細(xì)胞用常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，ox-LDL組細(xì)胞用含ox-LDL終濃度為100 μg/mL[7]的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。轉(zhuǎn)染si-NC、si-circ_0062389、miRNA-NC、miRNA-331-3p mimics、共轉(zhuǎn)染si-circ_0062389與anti-miRNA-NC、si-circ_0062389與anti-miRNA-331-3p的細(xì)胞均用含ox-LDL終濃度為100 μg/mL的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，并依次記為 ox-LDL+si-NC組(A組)、ox-LDL+si-circ_0062389組(B組)、ox-LDL+miRNA-NC組(C組)、ox-LDL+miRNA-331-3p組(D組)、ox-LDL+si-circ_0062389+anti-miRNA-NC組(E組)、ox-LDL+si-circ_0062389+anti-miRNA-331-3p組(F組)。培養(yǎng)結(jié)束后，收集各組細(xì)胞并用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)清洗2次，然后檢測(cè)以下指標(biāo)。

1.2.3RT-qPCR檢測(cè)circ_0062389和miRNA-331-3p表達(dá)

用RNA抽提試劑盒提取各組HUVEC中總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA后，行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)。引物序列：circ_0062389上游5′-GTA CGA GAT GAG TCG ACG CGC-3′，下游5′-CGA TAG GCG CGA GCG AGC-3′；miRNA-331-3p上游5′-TCG GCA GGG CCC CTG GGC CTA-3′，下游5′-GCC CCU GGG CCU AUC CUA GAA-3′；GAPDH上游5′-GTT GGA GGT CGG AGT CAA CGG-3′，下游5′-GAG GGA TCT CGC TCC TGG AGG A-3′；U6上游5′-GCT TCG GCA GCA CAT ATA CTA AAA T-3′，下游5′-CGC TTC AGA ATT TGC GTG TCA T-3′。2-ΔΔCt法計(jì)算circ_0062389 相對(duì)于GAPDH、miRNA-331-3p相對(duì)于U6的表達(dá)水平。

1.2.4酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)HUVEC中MDA水平及SOD和GSH-Px活性

向HUVEC中加入細(xì)胞裂解液，充分裂解細(xì)胞，3 500 r/min離心5 min，取上清液，分別參照MDA、SOD和GSH-Px試劑盒，檢測(cè)上清液中其表達(dá)水平。

1.2.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

向各組HUVEC中加500 μL結(jié)合緩沖液，將細(xì)胞重懸。然后利用Annexin V-FITC/PI試劑盒，依次加10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，室溫避光孵育15 min后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.2.6Western blot檢測(cè)cleaved-caspase3和cleaved-caspase9蛋白表達(dá)

將各組HUVEC中加放射免疫沉淀試驗(yàn)(radioimmunoprecipitation assay,RIPA)試劑，充分裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞中總蛋白。將蛋白溶液經(jīng)BCA法定量、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)、轉(zhuǎn)膜及封閉后，分別置于cleaved-caspase3(1∶1 000)、cleaved-caspase9(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)一抗孵育液，在4 ℃冰箱中孵育過(guò)夜。洗膜后置于山羊抗兔二抗(1∶2 000)孵育液中，在37 ℃搖床中孵育1 h。洗膜后加顯影液避光顯影，凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照，Image J軟件分析cleaved-caspase3和cleaved-caspase9相對(duì)于GAPDH表達(dá)水平。

1.2.7雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

根據(jù)Circular RNA Interactome靶基因在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè)circ_0062389與miRNA-331-3p核苷酸序列的結(jié)合位點(diǎn)，分別構(gòu)建circ_0062389野生型熒光素酶載體(WT-circ_0062389)及突變型熒光素酶載體(MUT-circ_0062389)，該過(guò)程由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)并完成。將HUVEC接種至6孔板中(1.0×105個(gè)/孔)，用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體法，分別將WT-circ_0062389和miRNA-NC、WT-circ_0062389和miRNA-331-3p mimic、MUT-circ_0062389和miRNA-NC、MUT-circ_0062389和miRNA-331-3p mimic共轉(zhuǎn)染至HUVEC中。轉(zhuǎn)染12 h后，更換新鮮培養(yǎng)液，再培養(yǎng)24 h收集細(xì)胞，加細(xì)胞裂解液裂解，3 500 r/min離心5 min，取上清液，參照熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光素酶活性，結(jié)果以螢火蟲(chóng)與海腎熒光強(qiáng)度的比值表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 ox-LDL組與Con組HUVEC中circ_0062389和miRNA-331-3p表達(dá)水平比較

ox-LDL組HUVEC中circ_0062389表達(dá)水平高于Con組(3.01±0.29vs.1.00±0.00，t=20.79，P<0.01)，而miRNA-331-3p表達(dá)水平低于Con組(0.33±0.03vs.1.00±0.00，t=67.00，P<0.01)。

2.2 各組HUVEC中MDA水平及SOD、GSH-Px活性比較

B組HUVEC中circ_0062389表達(dá)低于A組(0.23±0.03vs.1.00±0.00，t=77.00，P<0.01)。與Con組比較，ox-LDL組HUVEC中MDA水平升高(P<0.05)，SOD和GSH-Px活性降低(P<0.05)。與A組比較，B組HUVEC中MDA水平降低(P<0.05)，SOD和GSH-Px活性升高(P<0.05)。ox-LDL組與A組各檢測(cè)指標(biāo)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組HUVEC中MDA水平及SOD、GSH-Px活性比較

2.3 各組HUVEC中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

ox-LDL組HUVEC中細(xì)胞凋亡率高于Con組[(30.38±3.45)%vs.(5.14±0.43)%,P<0.05]，凋亡相關(guān)蛋白cleaved-caspase3和cleaved-caspase9表達(dá)水平高于Con組(P<0.05)。A、B組HUVEC中細(xì)胞凋亡率分別為(32.57±3.17)%、(10.14±0.84)%，與A組比較，B組HUVEC中細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)；且凋亡相關(guān)蛋白cleaved-caspase3和cleaved-caspase9表達(dá)水平均低于A組(P<0.05)。ox-LDL組與A組各檢測(cè)指標(biāo)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖1、2。

a:P<0.05,與Con組比較；b:P<0.05，與A組比較。

2.4 Circular RNA Interactome靶基因在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè)circ_0062389與miR-331-3p核苷酸序列的結(jié)合位點(diǎn)

Circular RNA Interactome靶基因在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè)顯示，circ_0062389與miRNA-331-3p的核苷酸序列存在結(jié)合位點(diǎn)，見(jiàn)圖3。雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染miRNA-331-3p mimics和WT-circ_0062389的HUVEC熒光素酶活性較共轉(zhuǎn)染miRNA-NC和WT-circ_0062389的細(xì)胞明顯降低(0.52±0.04vs.0.96±0.07，t=16.37，P<0.01)，但共轉(zhuǎn)染miRNA-331-3p mimics和MUT-circ_0062389的HUVEC熒光素酶活性與共轉(zhuǎn)染miRNA-NC和MUT-circ_0062389的細(xì)胞比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.99±0.07vs.0.98±0.08，t=0.28，P=0.78)。同時(shí)，轉(zhuǎn)染si-circ_0062389的HUVEC中miRNA-331-3p表達(dá)明顯高于轉(zhuǎn)染si-NC的細(xì)胞(3.01±0.28vs.1.03±0.06，t=20.74，P<0.01)。

圖2 各組HUVEC細(xì)胞凋亡流式圖

圖3 circ_0062389的序列中含有與miRNA-331-3p互補(bǔ)的核苷酸序列

2.5 C、D組HUVEC細(xì)胞損傷相關(guān)指標(biāo)比較

D組HUVEC中miRNA-331-3p表達(dá)高于C組細(xì)胞(3.79±0.31vs.1.00±0.00，t=27.00，P<0.01)。與C組比較，D組HUVEC中MDA水平降低(P<0.05)，SOD和GSH-Px活性升高(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白cleaved-caspase3和cleaved-caspase9表達(dá)水平均降低(P<0.05)，見(jiàn)表2、圖4。

A:Western blot檢測(cè)；B：蛋白相對(duì)表達(dá)水平柱狀圖；C、D：細(xì)胞凋亡流式圖；a:P<0.05,與C組比較。

表2 C、D組HUVEC細(xì)胞損傷相關(guān)指標(biāo)比較

2.6 E、F組HUVEC細(xì)胞損傷相關(guān)指標(biāo)比較

F組HUVEC中miRNA-331-3p表達(dá)低于E組細(xì)胞(0.26±0.02vs.1.00±0.00，t=111.00，P<0.01)。與E組比較，F(xiàn)組HUVEC中miRNA-331-3p表達(dá)水平降低(P<0.05)，MDA水平升高(P<0.05)，SOD和GSH-Px活性降低(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白cleaved-caspase3和cleaved-caspase9表達(dá)水平均升高(P<0.05),見(jiàn)圖5、表3。

A:Western blot檢測(cè)；B：蛋白相對(duì)表達(dá)水平柱狀圖；C、D：細(xì)胞凋亡流式圖；a:P<0.05,與E組比較。

表3 E、F組HUVEC細(xì)胞損傷相關(guān)指標(biāo)比較

3 討 論

ox-LDL是重要的致病因子，其可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)度氧化應(yīng)激反應(yīng)及細(xì)胞凋亡，促進(jìn)AS的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程[8]。本研究顯示，HUVEC經(jīng)100 μg/mL ox-LDL干預(yù)24 h后，細(xì)胞中氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA表達(dá)明顯增加，SOD和GSH-Px活性明顯降低，且細(xì)胞凋亡率升高，與相關(guān)報(bào)道結(jié)果一致[9]，說(shuō)明ox-LDL誘導(dǎo)HUVEC產(chǎn)生了氧化應(yīng)激反應(yīng)，且加劇了HUVEC凋亡，ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC損傷模型建立成功。

circRNA呈閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA，影響miRNA靶基因的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)功能。研究顯示，circRNA參與調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，可作為減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的分子靶點(diǎn)。如PENG等[10]研究顯示，circ-USP36可通過(guò)靶向miRNA-98-5p/VCAM1軸促進(jìn)ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及炎性反應(yīng)，減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，其有望成為治療AS的分子靶點(diǎn)；QIN等[11]研究顯示，circ_0003645的沉默可減輕ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及炎癥損傷，對(duì)揭示AS的發(fā)病機(jī)制及治療靶點(diǎn)的選擇提供了新途徑。探究影響AS血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的分子機(jī)制可為其治療提供新靶點(diǎn)。

circ_0062389是circRNA家族成員之一，可靶向miRNA-103a-3p/CCNE1軸促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的發(fā)展進(jìn)程，為非小細(xì)胞肺癌的治療提供了新策略[12]。本研究結(jié)果顯示，circ_0062389在ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC中表達(dá)升高，敲減其表達(dá)可明顯減少ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞凋亡，提示circ_0062389可能成為降低ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞損傷的分子靶點(diǎn)。細(xì)胞凋亡受多種基因分子調(diào)控，其中caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)對(duì)細(xì)胞凋亡發(fā)揮重要調(diào)控作用[13]。caspase9是caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的起始分子，再接受到上游凋亡信號(hào)后被活化，向下游傳遞凋亡信號(hào)。caspase3處于caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的核心位置，其被活化后，執(zhí)行細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果提示，circ_0062389可能通過(guò)間接抑制caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)來(lái)減少ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC凋亡。

ox-LDL引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激是血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的主要通路，抑制ox-LDL誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激可保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞免受氧化損傷[14]。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物之一，細(xì)胞中其水平越高，說(shuō)明氧化應(yīng)激反應(yīng)越劇烈。SOD是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化酶，其可清除氧自由基，減輕機(jī)體組織損傷。GSH-Px也是抗氧化酶，與SOD具有協(xié)同作用，對(duì)機(jī)體組織發(fā)揮保護(hù)作用。本研究顯示，敲減circ_0062389通過(guò)降低ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC中MDA表達(dá)及提高SOD和GSH-Px活性減輕細(xì)胞氧化損傷。

為了進(jìn)一步探究敲減circ_0062389抑制ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC氧化應(yīng)激和凋亡的分子機(jī)制，本研究證實(shí)了circ_0062389可靶向結(jié)合并負(fù)調(diào)控miRNA-331-3p，這與本文ox-LDL促進(jìn)HUVEC中circ_0062389的表達(dá)而抑制miRNA-331-3p表達(dá)的結(jié)果一致。有研究顯示，miRNA-331-3p在阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)患者血清中表達(dá)降低，且與AD患者簡(jiǎn)易智能精神狀態(tài)量表(mini-mental state examination,MMSE)評(píng)分和血清促炎細(xì)胞因子的表達(dá)密切相關(guān)，是診斷AD的潛在生物標(biāo)志物；過(guò)表達(dá)miRNA-331-3p可提高β-淀粉樣蛋白(amyloid beta,Aβ)1-40誘導(dǎo)的神經(jīng)母細(xì)胞瘤(SH-SY5Y)細(xì)胞活性，并抑制細(xì)胞炎性損傷，miRNA-331-3p具有潛在的神經(jīng)保護(hù)作用[15]。本研究結(jié)果顯示，miRNA-331-3p過(guò)表達(dá)明顯減輕了ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC氧化應(yīng)激水平，并減少了細(xì)胞凋亡，提示miRNA-331-3p可作為AS治療的分子靶點(diǎn)。此外，本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，敲減miRNA-331-3p逆轉(zhuǎn)敲減circ_0062389對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC氧化應(yīng)激及凋亡的抑制作用，進(jìn)一步提示circ_0062389可能通過(guò)靶向負(fù)調(diào)控miRNA-331-3p來(lái)影響ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC氧化應(yīng)激和凋亡，但其具體調(diào)控的miRNA-331-3p靶基因還有待進(jìn)一步探究。

綜上所述，ox-LDL促進(jìn)HUVEC中circ_0062389的表達(dá)，而抑制miRNA-331-3p表達(dá)；circ_0062389可能通過(guò)靶向抑制miRNA-331-3p來(lái)促進(jìn)ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC氧化應(yīng)激及凋亡，其可能成為AS治療的分子靶點(diǎn)。