魏慧慧 劉艷 殷劍峰 蘇麗紅★ 王玉梅★

游離DNA（cell-free DNA，cfDNA）作為新型的醫(yī)療診斷標(biāo)志物，自發(fā)現(xiàn)即迅速整合進(jìn)入腫瘤液態(tài)活檢、產(chǎn)前遺傳診斷等領(lǐng)域，極大地促進(jìn)了檢測技術(shù)的發(fā)展，成為重要的輔助診斷手段［1-2］。但血液樣品在常溫儲(chǔ)存及運(yùn)輸過程中，有核細(xì)胞極易破裂，導(dǎo)致基因組DNA 釋放、降解，造成血漿中游離DNA 成分污染及豐度降低。為確保游離DNA 的質(zhì)量以及后期檢測的準(zhǔn)確，保存管中必須添加防腐劑、核酸酶抑制劑以及有核細(xì)胞保護(hù)劑等添加劑［3］。其中，甘氨酸作為一種游離DNA 保護(hù)劑，對(duì)細(xì)胞腺嘌呤核苷三磷酸（Adenosine triphosphate，ATP）耗竭性損傷具有保護(hù)作用［4］。但在國家藥品監(jiān)督管理局頒布的現(xiàn)行行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中，除了涉及系列抗凝劑的檢測［5］，目前尚未形成對(duì)甘氨酸等添加劑的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法。同時(shí)，藥典中僅有針對(duì)藥品中甘氨酸含量的檢測方法，但不適合作為游離DNA保存管中添加劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法。本研究建立了游離DNA保存管中甘氨酸的定量測定方法，并選用市場上不同廠家的兩種保存管進(jìn)行應(yīng)用驗(yàn)證，用于游離DNA保存管的質(zhì)量控制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

TD5 離心機(jī)，購自湖南赫西儀器裝備有限公司；XSE205DU/81G 電子天平，購自梅特勒托利多公司；日立U-3310 紫外可見分光光度計(jì)，購自HITECH 公司；SpectraMax M5 酶標(biāo)儀，購自Molecular Devices 公司。甘氨酸國家標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)140689-201605，100 mg/支），中國食品藥品檢定研究院提供；茚三酮，純度99%，購自Alfa Aesar 公司；丙二醇甲醚，優(yōu)級(jí)純，購自沃凱化學(xué)試劑公司；硼氫化鈉，分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；冰醋酸，分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；三水醋酸鈉，分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制

1.2.1.1 基質(zhì)液 參照采血管中添加劑含量［5］及市場調(diào)研結(jié)果，稱取5.00 g 咪唑烷基脲、2.50 g EDTA·K2·2H2O，置于同一燒杯，加水溶解后，轉(zhuǎn)入25 mL 容量瓶，定容，配制含200.00 mg/mL 咪唑烷基脲、100.00 mg/mL EDTA·K2·2H2O 的基質(zhì)溶液?；|(zhì)液進(jìn)行50 倍稀釋，成稀釋液。

1.2.1.2 甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和模擬液 稱取甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)品75.00 mg，加入25 mL 容量瓶，加水溶解后定容，成甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（40.00 mmoL/L）；稱取甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)品187.50 mg，加入5 mL 容量瓶，加基質(zhì)液溶解，并以基質(zhì)液定容，成甘氨酸模擬液（500.00 mmoL/L）。

1.2.1.3 茚三酮反應(yīng)液 稱取4.00 g 茚三酮溶于95 mL 丙二醇甲醚，溶解后，加入8.10 mg 硼氫化鈉（視存放時(shí)間加入），攪拌溶解后過濾，加入丙二醇甲醚定容至100 mL，攪勻備用。

1.2.1.4 緩沖溶液 實(shí)驗(yàn)用水200 mL，丙二醇甲醚401 mL，冰醋酸123 mL，三水醋酸鈉338.40 g，加水定容至1 000 mL。

1.2.2 方法學(xué)建立

1.2.2.1 線性 以超純水對(duì)甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（40.00 mmoL/L）進(jìn)行稀釋，配制成0.63、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 mmoL/L 系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。取上述各標(biāo)準(zhǔn)溶液樣品1 mL 分別置于25 mL 刻度管，各加水補(bǔ)充至容積為8 mL，然后加入茚三酮和緩沖溶液各1 mL，混合均勻，于100℃水浴上加熱15 min，取出迅速冷卻至室溫，加水至標(biāo)線，搖勻。靜置15 min 后，在570 nm 波長下，以水為空白對(duì)照樣品，測定系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)溶液的甘氨酸濃度對(duì)其吸光度作直線回歸，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，相關(guān)系數(shù)（r）應(yīng)不小于0.99，各點(diǎn)回收率應(yīng)在85%～115%范圍內(nèi)。

1.2.2.2 檢出限與定量限 參考NLSI-EP17-A2 文件［6］，以稀釋液作為空白進(jìn)行40 孔平行測定，根據(jù)擬合直線的斜率，求得吸光度對(duì)應(yīng)的濃度，計(jì)算結(jié)果的平均值XB和標(biāo)準(zhǔn)偏差SDB，按照公式LOB=XB+ 1.645 SDB計(jì)算，獲得空白限LOB 濃度。根據(jù)計(jì)算結(jié)果，配制接近或高于空白限濃度的低值樣本，即LOB～4LOB 范圍內(nèi)4 個(gè)樣本，分別測定7次，根據(jù)擬合直線的方程分別計(jì)算低值樣本相應(yīng)濃度的均值ˉ和標(biāo)準(zhǔn)偏差SDsn，根據(jù)公式：/（n1+n2+n3+n4），計(jì)算方差的加權(quán)平均，從而得到樣本測量標(biāo)準(zhǔn)偏差的集合估計(jì)SDS。根據(jù)公式LOD=LoB+1.645 SDS計(jì)算檢測限LOD。同時(shí)參考LOQ=XB+10SDB以及常規(guī)使用濃度范圍，獲得設(shè)定的定量限LOQ 濃度和可接受總體誤差目標(biāo)0.75 mmol/L。分別平行不少于25 次測定設(shè)定濃度的檢測限和定量限樣品，并按照Bias+2 SDs 計(jì)算總體誤差，以驗(yàn)證LOD 和LOQ。

1.2.2.3 精密度 取甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（40.00 mmoL/L），用水稀釋，制備高、中、低濃度精密度樣品供試液（濃度分別為8.00、4.00、2.00 mmoL/L），分別平行6 個(gè)樣品進(jìn)行測定。根據(jù)公式RSD=SD/計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD。

1.2.2.4 準(zhǔn)確度和特異性 取模擬液0.18 mL，加入10 mL 刻度管，成理論靶值6.75 mg/支；取0.1 mL，加入5 mL 刻度管，成理論靶值3.75 mg/支。每種模擬樣品按照供試品檢測方法制備供試液，分別測定3 次，進(jìn)行回收率的計(jì)算，目標(biāo)設(shè)定為85%～115%。

1.2.2.5 供試品中甘氨酸添加量測定 隨機(jī)抽取兩種游離DNA 保存管各1 支（規(guī)格均為10 mL。產(chǎn)品技術(shù)要求：供試品1 添加劑濃度為4.00～6.00 mg/支，供試品2 添加劑濃度為8.10～9.90 mg/支，偏差均在15%），4 000 rpm（r=16.7 cm）縱向離心5 min。離心后取出，打開膠塞，加水至標(biāo)稱容量（抽吸體積或公稱液體容量）后，搖勻成供試液（或稀釋至合適的濃度）進(jìn)行檢測，將供試品的吸光度代入直線回歸方程，即得供試液的甘氨酸濃度Ct（mmoL/L）。另取2 支采血管，重復(fù)以上操作。按下式計(jì)算供試品中甘氨酸添加劑的含量。

m=Ct×V×75/1 000

式中：m-采血管中甘氨酸添加劑的含量，單位為毫克（mg）；Ct-供試液的甘氨酸測定濃度，單位為毫摩爾/升（mmoL/L）；V-采血管的標(biāo)稱容量（抽吸體積或公稱液體容量），或稀釋后定容體積，單位為毫升（mL）。

2 結(jié)果

2.1 線性

本方法檢測的線性范圍確定為0.63～10.00 mmoL/L，在此范圍內(nèi)，線性相關(guān)性較好，相關(guān)系數(shù)r=0.996 6。見圖1。

2.2 檢測限和定量限

在0.63～10.00 mmoL/L 線性范圍內(nèi)，經(jīng)計(jì)算空白限LOB 為0.80 mmoL/L，檢測限LOD 為1.00 mmoL/L，定量限LOQ 為2.00 mmoL/L，總體誤差為0.32 mmoL/L。

2.3 精密度

低、中、高（濃度分別為2.00、4.00、8.00 mmoL/L）各6 個(gè)樣測定結(jié)果見表1。

表1 不同濃度樣本的精密度檢測結(jié)果（n=6）Table 1 Precision test results of samples with different concentrations（n=6）

2.4 準(zhǔn)確度和特異性

以甘氨酸國家標(biāo)準(zhǔn)品配制的含有常規(guī)基質(zhì)成份的模擬樣品，經(jīng)檢測并換算到單支含量，與理論靶值比較，回收率結(jié)果均在85%～115%內(nèi)，與設(shè)定的預(yù)期目標(biāo)一致；未發(fā)現(xiàn)基質(zhì)中常規(guī)存在的高咪唑烷基脲與EDTA·K2·2H2O 成份對(duì)檢測結(jié)果有明顯干擾，方法具有較好的準(zhǔn)確性和特異性。見表2。

表2 準(zhǔn)確度和特異性檢測結(jié)果Table 2 Accuracy and specificity test results

2.5 供試品測定

檢測兩種不同含量（如表3技術(shù)要求所示）的供試品，結(jié)果均在其產(chǎn)品靶值范圍內(nèi)，符合技術(shù)要求規(guī)定。見表3。

表3 供試品測定結(jié)果Table 3 The test results of the tested products

3 討論

循環(huán)血液游離DNA 作為非侵入性疾病的生物標(biāo)志物，可直接應(yīng)用于下游檢測，如數(shù)字PCR 和高通量測序等［7-9］，是微創(chuàng)診斷、改善疾病監(jiān)測、臨床決策和患者預(yù)后的關(guān)鍵［10-11］，相關(guān)體外診斷試劑盒也一直是申報(bào)的熱點(diǎn)，因此，游離DNA 的保存質(zhì)量對(duì)后續(xù)的臨床檢測結(jié)果起重要作用［12-14］。目前上市的一次性真空采血管較多，但未查到獲批的針對(duì)游離DNA 保存的采血管或保存管，意味著目前各醫(yī)療檢測機(jī)構(gòu)在進(jìn)行高通量測序或其他使用游離DNA 樣本時(shí)使用的保存管均處于不被監(jiān)管的狀態(tài)，屬于監(jiān)管漏洞。由于沒有可參考的針對(duì)游離DNA 保存管的評(píng)價(jià)方法，筆者在接收的檢驗(yàn)中，也是發(fā)現(xiàn)了企業(yè)在制定技術(shù)要求時(shí)，有的故意回避該項(xiàng)檢驗(yàn)，只作為常規(guī)采血管進(jìn)行。

本研究建立了一種基于茚三酮反應(yīng)的游離DNA 保存管中甘氨酸的定量檢測方法，優(yōu)化后線性范圍為0.63～10.00 mmoL/L，滿足設(shè)定相關(guān)系數(shù)0.99的要求，且在此范圍內(nèi)，各濃度點(diǎn)回收率在85%～115%范圍內(nèi)；經(jīng)驗(yàn)證確立該方法的檢測限為1.00 mmoL/L，與使用3SDB計(jì)算檢測限的方法一致。根據(jù)大量專利文獻(xiàn)及生產(chǎn)廠家的調(diào)研，保存液中甘氨酸添加劑濃度為200.00～600.00 mmol/L（15.00～50.00 mg/mL），參考其最佳作用濃度5.00 mmol/L（相當(dāng)于保存液中250.00 mmol/L），因而，可接受總體誤差目標(biāo)0.75 mmol/L 經(jīng)評(píng)估是合理的，而誤差間距-0.32～0.32 mmoL/L 恰好落在誤差目標(biāo)-0.75～0.75 mmoL/L 范圍內(nèi)，因而LOQ 獲得驗(yàn)證，確定為2.00 mmoL/L，且能夠滿足該產(chǎn)品的檢測要求。

運(yùn)用低、中、高3 個(gè)濃度驗(yàn)證了方法分析內(nèi)的精密度，在常規(guī)應(yīng)用濃度范圍內(nèi)，其標(biāo)準(zhǔn)偏差均不大于10%，檢測結(jié)果重復(fù)性較好。以甘氨酸國家標(biāo)準(zhǔn)品配制模擬樣品，以加標(biāo)回收的方法驗(yàn)證了方法的準(zhǔn)確度與特異性，回收率結(jié)果在85%～115%內(nèi)，說明方法具有較好的準(zhǔn)確性；且基質(zhì)溶液的存在下，不受常見添加劑干擾測定，特異性較好。同時(shí)，以所建立的方法初步用于游離DNA 保存管檢測，結(jié)果均符合產(chǎn)品技術(shù)要求規(guī)定。

本方法經(jīng)過了山東省醫(yī)療器械檢測中心、江蘇康為世紀(jì)生物科技股份有限公司、廣州陽普醫(yī)療科技股份有限公司等多家驗(yàn)證，其線性、準(zhǔn)確性、精密度、特異性均符合作為該特殊采血管評(píng)價(jià)的要求。在驗(yàn)證工作中，由于接觸到的是真實(shí)的產(chǎn)品，各家添加量的不同，也碰到由于稀釋倍數(shù)過低，在加熱過程出現(xiàn)沉淀析出的現(xiàn)象，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此，實(shí)際應(yīng)用時(shí)需要了解產(chǎn)品的添加劑濃度范圍，以設(shè)計(jì)更好的樣本處理方案。通過驗(yàn)證，考慮到實(shí)際的添加量范圍以及使用者設(shè)備的響應(yīng)范圍，最終將標(biāo)準(zhǔn)中的線性范圍修改為2.00～10.00 mmoL/L，大大提高了檢測的準(zhǔn)確性。同時(shí)，基于該研究成果，筆者起草并申報(bào)了醫(yī)療器械行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中“一次性使用人體靜脈血樣采集容器中添加劑量第5 部分-甘氨酸”。本標(biāo)準(zhǔn)的制定將統(tǒng)一檢測方法，規(guī)范行業(yè)要求，便于產(chǎn)品質(zhì)量控制，為采血管的市場監(jiān)管提供有效的技術(shù)支持。