劉東來(lái) 沈舒 田穎新 周海衛(wèi) 張櫻★ 許四宏★

新冠肺炎疫情發(fā)生后之所以能快速鎖定病原、揭示新型冠狀病毒基因組，得益于病原宏基因組高通量測(cè)序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）技術(shù)近年來(lái)的快速發(fā)展和應(yīng)用［1-2］。相比傳統(tǒng)分子診斷技術(shù)，mNGS 技術(shù)具有更廣泛的檢測(cè)譜，尤其適合臨床不明病因感染的輔助診斷。目前，我國(guó)mNGS 行業(yè)在產(chǎn)品轉(zhuǎn)化速度和臨床普及程度兩方面均領(lǐng)先國(guó)外［1-3］。然而，mNGS 技術(shù)現(xiàn)階段仍存在較多技術(shù)問(wèn)題，且缺乏相關(guān)質(zhì)量控制方法和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，給醫(yī)療機(jī)構(gòu)本地化應(yīng)用帶來(lái)困擾和挑戰(zhàn)［1］。醫(yī)療機(jī)構(gòu)為保證mNGS 本地化的有序發(fā)展、規(guī)范管理及合理使用，有必要進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)或性能確認(rèn)［2］。國(guó)家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心、中國(guó)醫(yī)學(xué)科院北京協(xié)和醫(yī)院以及本課題組均開展過(guò)相關(guān)研究［3-5］。參考品是mNGS 技術(shù)質(zhì)量評(píng)價(jià)體系及標(biāo)準(zhǔn)的重要基礎(chǔ)。為便于醫(yī)療機(jī)構(gòu)更高效地開展mNGS 本地化檢測(cè)系統(tǒng)的質(zhì)量評(píng)價(jià)活動(dòng)，本研究建立了包含10 種微生物的mNGS 參考品及其使用方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 參考品候選樣本

參考品候選樣本包括微生物及人源細(xì)胞。微生物包括格氏李斯特菌、副流感嗜血桿菌、瓊氏不動(dòng)桿菌、馬紅球菌、藤黃微球菌、干燥奈瑟菌、熒光假單胞菌、嗜水氣單胞菌、嗜肺軍團(tuán)菌及葡萄牙念珠菌等10 種細(xì)菌和真菌，由中國(guó)食品藥品檢定研究院保存并提供。人源細(xì)胞為Hela 細(xì)胞系由深圳華大因源醫(yī)藥科技有限公司提供。

1.1.2 試劑及儀器

微生物培養(yǎng)及鑒定使用全自動(dòng)細(xì)菌鑒定分析系統(tǒng)（型號(hào)VITEK2）及配套的微生物鑒定卡均由梅里埃診斷產(chǎn)品（上海）有限公司生產(chǎn)。

參考品前處理使用湖北新縱科病毒疾病工程技術(shù)有限公司生產(chǎn)的高效組織細(xì)胞樣品處理儀（型號(hào)NOVAprep DS1000）。核酸定量使用賽默飛世爾公司生產(chǎn)的核酸定量熒光儀（型號(hào)Qubit 4）及配套的雙鏈DNA 熒光定量檢測(cè)試劑盒（Qubit dsDNA HS）。核酸提取純化的核酸純化試劑（柱提法），核酸打斷使用的核酸酶切反應(yīng)通用試劑盒，測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建使用的PMseq 感染病原高通量基因檢測(cè)試劑盒，測(cè)序使用的基因測(cè)序儀（型號(hào)BGISEQ-50）及配套的高通量測(cè)序試劑套裝（FCL SE50），生物信息學(xué)分析使用的病原微生物基因檢測(cè)軟件，均由深圳華大因源醫(yī)藥科技有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 候選樣本培養(yǎng)及鑒定

不同微生物選擇合適的培養(yǎng)方法，參考本課題組前期報(bào)道［6］。

1.2.2 菌株濃度測(cè)定

微生物的菌落形成單位（colony forming unit，CFU）濃度使用梯度稀釋法進(jìn)行測(cè)定，參考本課題組前期報(bào)道［6］。

1.2.3 參考品制備及驗(yàn)證

制備方法參考本課題組前期報(bào)道［3，6］，將5 種微生物與人源細(xì)胞按不同濃度進(jìn)行混合：不含微生物、微生物濃度分別為105、104及103CFU/mL，人源細(xì)胞均為105cells/mL 的參考品；人源細(xì)胞濃度分別為105、104及103cells/mL，微生物濃度均為103CFU/mL 的參考品。

參考品使用方法：陽(yáng)性符合率和陰性符合率參考品檢測(cè)1 次；重復(fù)性參考品檢測(cè)3 次，并分別計(jì)算各微生物檢出序列數(shù)的變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）；檢出限和線性參考品檢測(cè)1 次，并分別計(jì)算不同人源細(xì)胞和微生物濃度梯度系列參考品中各微生物檢出序列數(shù)的線性相關(guān)系數(shù)的絕對(duì)值|r|。

1.2.4 參考品穩(wěn)定性研究

參考品置于室溫條件（約25℃）2 次凍融后進(jìn)行檢測(cè)，與正常儲(chǔ)存（低于-70℃）的參考品的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，研究?jī)鋈诜€(wěn)定性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

重復(fù)性中，用3 次重復(fù)檢測(cè)結(jié)果中各微生物檢出序列數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)差（SD）除以平均值（），計(jì)算變異系數(shù)CV。線性中，3 個(gè)濃度水平樣本檢測(cè)結(jié)果中各微生物檢出序列數(shù)和濃度梯度比例用最小二乘法進(jìn)行直線擬合，計(jì)算線性相關(guān)系數(shù)r。

2 結(jié)果

2.1 參考品組成

空白參考品D0 以及分別含有5 種微生物的D1 和D2 系列參考品組成見表1。

表1 病原宏基因組高通量測(cè)序技術(shù)質(zhì)量評(píng)價(jià)參考品組成Table 1 Composition of reference panel for quality evaluation of pathogen metagenomic next-generation sequencing

2.2 參考品驗(yàn)證結(jié)果

使用病原宏基因組高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)制備好的參考品，參考品范圍內(nèi)的微生物均檢出。見表2。

表2 參考品病原宏基因組高通量測(cè)序檢測(cè)結(jié)果Table 2 Results of detection of reference panel by pathogen metagenomic next-generation sequencing

參考品D1-2 和D2-2 各個(gè)微生物3 次檢測(cè)的檢出序列數(shù)的變異系數(shù)均小于50%，其中7 個(gè)微生物的變異系數(shù)小于30%，見表3。參考品D1-1、D1-2 和D1-3，D1-3、D1-2（10）和D1-1（100），D2-1、D2-2 和D2-3，以及D2-3、D2-2（10）和D2-1（100）各個(gè)微生物檢出序列數(shù)的線性相關(guān)系數(shù)的絕對(duì)值|r|均大于0.86。見表3。

表3 變異系數(shù)及線性相關(guān)系數(shù)計(jì)算結(jié)果Table 3 Calculation results of coefficient of variation and linear correlation coefficient

2.3 參考品穩(wěn)定性

分別對(duì)未凍融和凍融過(guò)的參考品D1-3和D2-3進(jìn)行檢測(cè)，未凍融和凍融1 次時(shí)各微生物檢出序列數(shù)未見明顯差異，凍融2 次后檢出序列數(shù)均下降。見表4。因此，凍融2 次的參考品不宜繼續(xù)使用。

表4 參考品凍融穩(wěn)定性研究結(jié)果Table 4 Results of study on freeze-thaw stability of reference panel

3 討論

mNGS 技術(shù)對(duì)于新發(fā)病原體感染、復(fù)雜及混合感染以及不明原因感染的診斷獨(dú)具優(yōu)勢(shì)［1，7-14］。2021年2月，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局修訂《醫(yī)療器械監(jiān)督管理?xiàng)l例》，規(guī)定“對(duì)國(guó)內(nèi)尚無(wú)同品種產(chǎn)品上市的體外診斷試劑，符合條件的醫(yī)療機(jī)構(gòu)根據(jù)本單位的臨床需要，可以自行研制，在執(zhí)業(yè)醫(yī)師指導(dǎo)下在本單位內(nèi)使用”；2021年7月，《中共中央國(guó)務(wù)院關(guān)于支持浦東新區(qū)高水平改革開放打造社會(huì)主義現(xiàn)代化建設(shè)引領(lǐng)區(qū)的意見》，提出“允許有條件的醫(yī)療機(jī)構(gòu)按照相關(guān)要求開展自行研制體外診斷試劑試點(diǎn)”。技術(shù)優(yōu)勢(shì)和政策支持正推動(dòng)mNGS技術(shù)開啟醫(yī)療機(jī)構(gòu)本地化建設(shè)的新篇章［2］。然而，mNGS 檢測(cè)流程對(duì)環(huán)境、儀器及人員專業(yè)技術(shù)能力要求極高，醫(yī)療機(jī)構(gòu)在正式開展mNGS 本地化檢測(cè)前需要進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)［2，5］。盡管已有多個(gè)研究團(tuán)隊(duì)報(bào)道過(guò)相關(guān)研究，但仍未建立公認(rèn)的適合于醫(yī)療機(jī)構(gòu)的本地化質(zhì)量評(píng)價(jià)模式或方案［3-5，15］。

本參考品的微生物選擇原則和使用方法是對(duì)以往研究的繼承和創(chuàng)新［3-6，10］。微生物選擇原則包括：①參考品組成包括人源細(xì)胞和微生物，可以模擬臨床感染樣本。②mNGS 檢測(cè)范圍理論覆蓋其生物信息學(xué)分析流程中使用數(shù)據(jù)庫(kù)里面的全部病原體，全部驗(yàn)證不具有可操性，因此常選擇少數(shù)幾種進(jìn)行驗(yàn)證。③參考品中含有較高濃度微生物，且進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)時(shí)在短期內(nèi)需完成大量檢測(cè)，存在氣溶膠污染風(fēng)險(xiǎn)。④選擇臨床不常見、但與臨床常見微生物種屬相近的物種進(jìn)行“代表性”驗(yàn)證，可以最大程度不干擾醫(yī)療機(jī)構(gòu)日常檢驗(yàn)工作。⑤通過(guò)考察檢測(cè)結(jié)果中，是否將參考品中臨床不常見微生物誤報(bào)為其近緣的臨床微生物，來(lái)評(píng)價(jià)檢測(cè)的準(zhǔn)確性和特異性（即假陽(yáng)性）。⑥通過(guò)設(shè)置僅含人源細(xì)胞、不含微生物的空白參考品，可以對(duì)整體的檢測(cè)結(jié)果情況進(jìn)行校正。

本參考品使用方法：①以往研究提示人源細(xì)胞背景對(duì)mNGS 檢出限有潛在影響［1-5］，本參考品通過(guò)設(shè)置3 種人源細(xì)胞水平，可以清晰地看到，微生物檢出序列數(shù)隨著人源細(xì)胞濃度增加而降低，提示高濃度的人源細(xì)胞有可能影響mNGS 的檢出限。②通過(guò)檢測(cè)“固定人源細(xì)胞-微生物梯度降低”和“固定微生物-人源細(xì)胞梯度降低”兩組參考品，并計(jì)算各微生物檢出序列數(shù)的線性相關(guān)系數(shù)，可以分析檢測(cè)的穩(wěn)定性（即魯棒性）。③僅用15 個(gè)測(cè)試，即可快速高效地對(duì)陽(yáng)性符合率、陰性符合率、重復(fù)性、檢出限及線性等性能指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

綜上所述，本課題組建立了病原宏基因組高通量測(cè)序技術(shù)質(zhì)量評(píng)價(jià)參考品及使用方法，包括1 個(gè)空白和10 個(gè)微生物參考品。使用該參考品，本課題組聯(lián)合幾十家醫(yī)院，于2021年開展了全國(guó)醫(yī)療機(jī)構(gòu)mNGS 本地化質(zhì)量評(píng)價(jià)聯(lián)合研究（數(shù)據(jù)整理分析中），以期為醫(yī)療機(jī)構(gòu)開展mNGS 本地化建設(shè)提供支持。