李翔 董占柱 陳昊 孫欣 包春喜 李英智 牛藝卿 郝明媛 趙志軍 杜彥丹★

布魯氏菌?。˙rucellosis）是由布魯氏菌屬的細(xì)菌（Brucella）侵入機(jī)體，引起傳染-變態(tài)反應(yīng)性的人獸共患的傳染病。臨床上以長期發(fā)熱、多汗、乏力、關(guān)節(jié)疼痛、肝脾及淋巴結(jié)腫大為特點(diǎn)［1］。人群易感，多因病致貧。布病的診斷以實(shí)驗(yàn)室檢查為主，結(jié)合流行病史、臨床表現(xiàn)、影像學(xué)手段等綜合判斷［2］。目前，檢測布氏菌的常用技術(shù)均存在一定局限性，如血培養(yǎng)技術(shù)耗時長、檢出率低；虎紅平板凝集試驗(yàn)、試管凝集特異性不高；補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)敏感性低；傳統(tǒng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）操作繁瑣涉及生物安全等。微流控芯片-PCR（Microfluidic Chip PCR，MCPCR）技術(shù)可將樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測等集成到一塊芯片上并自動完成，具有快速、高通量、低消耗，靈敏、特異等特點(diǎn)［3-4］。其技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于HPV［5］、結(jié)核［6］、腫瘤［7］等疾病的檢測。近年來布病的國內(nèi)外的發(fā)病率出現(xiàn)逐年上升的勢頭［8-9］，探究MC-PCR 技術(shù)與布氏菌檢測相結(jié)合，提高布氏菌檢測、診斷能力十分必要。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

收集2021年呼倫貝爾市傳染病醫(yī)院80 例布氏菌試管凝集實(shí)驗(yàn)陽性患者血液樣本，3 000 r/min轉(zhuǎn)速處理5 min，離心半徑15 cm，分離血清，布氏菌懸液及陰性血清樣本由內(nèi)蒙古林業(yè)總醫(yī)院提供。陽性樣本及布氏菌懸液均采用56℃30 min 進(jìn)行滅活，-80℃冷藏。布氏菌質(zhì)粒為北京睿博興科生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

研發(fā)適合MC 技術(shù)的布氏菌核酸提取試劑、PCR 擴(kuò)增條件、反向斑點(diǎn)雜交試劑；設(shè)計(jì)MC-PCR與基因測序符合性測試、比較MC-PCR 法與碩世生物科技qPCR 法、上海之江生物科技TaqMan 探針法、臨床診斷結(jié)果；評估MC-PCR 重復(fù)性、準(zhǔn)確性、特異性、最低檢出限。

1.2.1 DNA 提取

采用5×105CFU/mL 濃度胎牛血清加布氏菌懸液作為樣本。MC 布氏菌提取試劑50 μL 血清+50 μL ddH2O+100 μL 裂解液+5 μLPK+10 μL 磁珠+100 μL 異丙醇，6M 裂解液，裂解2 min 在全自動核酸芯片檢測儀（北京博暉創(chuàng)新生物技術(shù)股份有限公司，型號：BHF-VI）上進(jìn)行核酸提取、產(chǎn)物PCR 檢測結(jié)果設(shè)為研究組；AXYGEN 柱式核酸檢提取劑盒、天凈沙柱式血液核酸提取試劑盒、全式金（離心柱）核酸提取試劑盒、天根血液基因組DNA 提取試劑盒、德諾杰億核酸提取試劑、濟(jì)凡生物科技濟(jì)凡快速磁珠法血液基因組提取試劑盒及研發(fā)的手工提取試劑共7 種試劑提取產(chǎn)物分別PCR 檢測結(jié)果設(shè)為對照組。

1.2.2 PCR 擴(kuò)增

采用美國ABI 7500 實(shí)時熒光定量PCR 儀對提取的產(chǎn)物檢測。根據(jù)布氏菌BCSP31 蛋白編碼的基因，使用Oligo7 和Allele ID6 軟件設(shè)計(jì)出適合微流控芯片檢測的引物（5′-ACCTTGCCCTTGCCATCAT-3′）（5′-AGTCCGGCTTTACGCAGTCA-3′）以及探針（TGCCGTTATAGGCCCAATA GGCAAC G）。采用15 μL PCR 反應(yīng)體系，主要包括：諾唯贊通用型高靈敏度染料法定量PCR 檢測酶7.5 μL，正、反向引物各1.5 μL（0.5 μmoL/μL）ddH2O：1.5 μL 核酸模板3 μL。MC-PCR 用諾唯贊高純度耐熱DNA 聚合酶，檢測使用BHF-VI，其它與實(shí)時熒光定量實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增體系參數(shù)一致。

1.2.3 反向斑點(diǎn)雜交

MC 技術(shù)反向斑點(diǎn)雜交試劑使用微量點(diǎn)樣技術(shù)，在BHF-VI 上進(jìn)行自動提取反向斑點(diǎn)雜交、顯示和結(jié)果分析。見圖1。

圖1 微流控探針排布Figure 1 Microfluidic probe arrangement

1.2.4 微流控芯片結(jié)果判定

實(shí)驗(yàn)過程中設(shè)立的陰陽性對照必須BS、GB 和SP 位置處均出現(xiàn)陽性斑點(diǎn)，否則提示核酸提取、PCR 擴(kuò)增或雜交失敗。試劑盒內(nèi)的陰性對照必須在GB 和SP 位置出現(xiàn)陽性斑點(diǎn)，其他位置均不能出現(xiàn)陽性斑點(diǎn)，否則有可能發(fā)生污染。

1.2.5 符合性測試

采用80 例試管凝集試驗(yàn)陽性血清為樣本，使用MC-PCR 試劑在BHF-VI 上檢測，與MC-PCR 提取的產(chǎn)物在華大基因北京公司的基因測序結(jié)果進(jìn)行符合性比較；與碩世生物科技（qPCR）、上海之江生物科技的布菌核酸檢測試劑盒（TaqMan 探針）在ABI 7500 PCR 儀上檢測結(jié)果進(jìn)行比較；與臨床診斷結(jié)果比較。

1.3 MC-PCR 性能評估

使用MC-PCR 重復(fù)性：檢測濃度1 000 copies/mL 布氏菌質(zhì)粒參考品22 次；精密度：檢測100 CFU/mL 布氏菌懸液10 次；準(zhǔn)確性：檢測濃度1 000 copies/mL 布氏菌質(zhì)粒參考品及濃度1.0×105copies/mL 人胚胎腎HEK293 細(xì)胞陰性參考品；特異性：檢測濃度2.5 ×105copies/mL EB 病毒、2.1×105copies/mL 人巨細(xì)胞病毒、3.0×106copies/mL 金黃色葡萄球菌、1.8×106copies/mL 肺炎鏈球菌14 型、1.0×105copies/mL 人胚胎腎HEK293 細(xì)胞。檢出限：檢測梯度濃度布氏菌質(zhì)粒。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 26 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；計(jì)量資料采用（±s）描述，多組間比較采用方差分析；計(jì)數(shù)資料采用（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；不同檢驗(yàn)方法之間的一致性采用kappa 檢驗(yàn)分析；以P＜0.05 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究組與對照組提取布氏菌核酸實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

研究組與對照組核酸溶解曲線圖縱坐標(biāo)峰值所對應(yīng)的橫坐標(biāo)一致，呈現(xiàn)單一的溶解峰，溫度相同，表示為相同的擴(kuò)增產(chǎn)物。見圖2；研究組布氏菌核酸最早在27 個循環(huán)就達(dá)到設(shè)定的閾值，核酸不同提取方法之間Ct 值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。NaI（機(jī)提）的Ct 值低于AXYGEN、天凈沙、濟(jì)凡、NaI（手提），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；NaI（機(jī)提）的Ct 值與全式金、天根、德諾杰億差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1、圖3。

表1 不同提取方法之間CT 值比較（±s）Table 1 Comparison of the CT values between the different extraction methods（±s）

表1 不同提取方法之間CT 值比較（±s）Table 1 Comparison of the CT values between the different extraction methods（±s）

提取方法AXYGEN天凈沙全式金天根德諾杰億濟(jì)凡NaI(手提）NaI(機(jī)提）CT 值29.95±0.29 32.94±0.19 28.07±0.08 27.81±0.29 27.26±0.86 31.85±0.55 29.24±0.30 27.68±0.26 F 值P 值14.935＜0.001

圖2 布氏菌核酸QPCR 溶解曲線Figure 2 QPCR dissolution curve of Brucellosis nucleic acid

圖3 布氏菌核酸QPCR 擴(kuò)增曲線Figure 3 QPCR amplification curve of Brucella nucleic aci

2.2 符合性測試結(jié)果

基因測序的Kappa 值為0.659，與MC-PCR 具有高度的一致性，MC-PCR 與基因測序陽性結(jié)果符合率100%，總符合率82.5%。見表2。

表2 不同方法的符合性測試結(jié)果Table 2 Compliance test results of different methods

2.3 MC-PCR 性能評估結(jié)果

準(zhǔn)確性：結(jié)果符合率為100%；特異性：結(jié)果陰性率100%；重復(fù)性：結(jié)果均可以檢出布氏菌；檢出限：濃度為825 copies/mL時，MC-PCR與qPCR、TaqMan探針法檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=24.699，P＜0.05），經(jīng)兩兩比較，MC-PCR 檢出率高于qPCR和TaqMan 探針法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。精密度：結(jié)果均可以檢出布氏菌。見表3、圖4。

表3 MC-PCR 與qPCR、TaMan 探針法檢出限比較實(shí)驗(yàn)Table 3 Comparison of detection limits of MC-PCR，qPCR and Taman methods

圖4 精密度參考品微流全流程檢測結(jié)果Figure 4 Results of microflow of precision reference

3 討論

布病是一種易被忽視的人畜共患病，不僅嚴(yán)重危害人民身體健康，而且影響畜牧業(yè)、旅游業(yè)、國際貿(mào)易的發(fā)展，還會帶來食品安全隱患［10］，其已經(jīng)成為我國法定的乙類傳染病之一。內(nèi)蒙古畜牧業(yè)發(fā)達(dá)，畜牧業(yè)交易、運(yùn)輸?shù)幕钴S，致使布病疫情從牧區(qū)向半牧區(qū)、農(nóng)區(qū)以及城市蔓延。雖然檢測出布氏菌是診斷布病的金標(biāo)準(zhǔn)［11-12］。但由于布氏菌培養(yǎng)營養(yǎng)要求高，生長緩慢，往往會延誤診斷及早期治療，故不能成為診斷布病的主要方法。血清學(xué)診斷缺乏國際化的參考標(biāo)準(zhǔn)，具有診斷學(xué)意義的血清布氏菌抗體滴度尚未確定。傳統(tǒng)的布氏菌核酸檢測試劑盒多數(shù)是以手工提取核酸為主要方法，提取過程繁瑣，提取效率不高，穩(wěn)定性不好，此外，多數(shù)檢測機(jī)構(gòu)環(huán)境難以達(dá)到《病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全環(huán)境管理辦法》中布魯氏菌活菌檢測要求［13］。雖然布氏菌的檢測技術(shù)已經(jīng)有了很大的發(fā)展，但是，仍然沒有一種單一的方法能在任何情況下進(jìn)行安全、快速、準(zhǔn)確的檢測。因此，找到快速、準(zhǔn)確、安全的診斷布病的檢測方法至關(guān)重要。

MC 的適時出現(xiàn)為分子診斷研究開啟了新的大門，MC 是指在微米級別流道上對微流體或微反應(yīng)體系進(jìn)行精準(zhǔn)操控與分析檢測的科學(xué)技術(shù)，具有自動、高效、快速、集成、低消耗且靈敏、特異等優(yōu)點(diǎn)［14］。用MC 技術(shù)將PCR 核酸提取、PCR 擴(kuò)增、RDB 集合到一個芯片上建立起微型化的MC-PCR檢測布氏菌DNA 反應(yīng)體系，其能克服PCR 需要較多的試劑、加熱時間長、冷卻時間長等缺點(diǎn)，消除了因離心、混合和凍融步驟所導(dǎo)致的場地問題，從而解決PCR 擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)化問題。此外，該技術(shù)還可以避免樣品在多步處理過程中出現(xiàn)內(nèi)源性核糖核酸酶激活、不適pH 值和溫度導(dǎo)致的樣品降解［15］等。研究表明這種能快速分離出細(xì)菌及病毒的DNA，并在最小化人為干預(yù)的情況下將其傳送到檢測裝置傳感器的封閉集成單元內(nèi)的微流控系統(tǒng)是目前傳染病檢測的最佳選擇。且儀器操作穩(wěn)定性高，可以實(shí)現(xiàn)布氏菌檢測的誤差最小化，自動化操作極大減少了實(shí)驗(yàn)人員感染風(fēng)險(xiǎn)，這將是現(xiàn)階段最好的布氏菌核酸提取和檢測方法。

MC-PCR 與基因測序、TaqMan 探針法、qPCR檢測陽性結(jié)果符合率為100%、100%和97.3%，1 例QPCR 陽性、MC-PCR 陰性樣本基因測序?yàn)殛幮越Y(jié)果，8 例QPCR 陰性、MC-PCR 陽性樣本測序后為陽性結(jié)果，MC-PCR 與基因測序結(jié)果更符合，說明MC-PCR 檢出研究組的結(jié)果更準(zhǔn)確。因?yàn)镸CPCR 在PCR 擴(kuò)增后又進(jìn)行了RDB。RDB 是將針對BCSP31 基因組設(shè)計(jì)的引物的探針包被在芯片檢測區(qū)的雜交膜上，若擴(kuò)增產(chǎn)物中含有目的基因，則可被芯片上的探針捕獲，與膜上探針相結(jié)合，結(jié)合形成復(fù)合物，特異性強(qiáng)，經(jīng)酶和顯色反復(fù)潤洗，形成可見的斑點(diǎn)，就可判斷感染了布氏菌，這可顯著降低假陽性率和假陰性率［16］。通過RDB 技術(shù)不僅可以提高布氏菌核酸的檢測效率，還增加了實(shí)驗(yàn)的特異性和準(zhǔn)確性。MC-PCR 陽性率高是MC-PCR 的檢出限最低，對布氏菌檢測最敏感，這對布病的早期診斷以及鑒別布病慢性期與急性期都有幫助。與臨床診斷較低的一致性，分析是臨床醫(yī)生常根據(jù)布病血清免疫學(xué)試管凝集實(shí)驗(yàn)和臨床癥狀對布病進(jìn)行診斷，但對一些試管凝集實(shí)驗(yàn)陽性且與布氏菌感染癥狀相似的患者無法準(zhǔn)確診斷是否是布病感染，導(dǎo)致會出現(xiàn)一部分假陽性的病例。試管凝集實(shí)驗(yàn)是對血清中總抗體（包括IgM和IgG）進(jìn)行檢測，可能會與其它細(xì)菌存在著一定量交叉反應(yīng)，導(dǎo)致假陽性率偏高，特異性不強(qiáng)，同時血清抗體在體內(nèi)可以長時間存在，即使一些患者痊愈且沒有癥狀，但對其血清進(jìn)行檢測仍然會出現(xiàn)一些較高滴度抗體的情況［17］。由于布病國家診斷標(biāo)準(zhǔn)的局限性，誤診漏診不可避免［11-12］。

綜上所述MC-PCR 技術(shù)檢測布氏菌重復(fù)性、準(zhǔn)確性、特異性、檢出限的性能均優(yōu)于一般布氏菌核酸檢測試劑盒，且檢測方法安全、快捷、及時、精準(zhǔn)。該技術(shù)的應(yīng)用將提高布病診斷率和診斷準(zhǔn)確率，有效地減少誤診、漏診，對布魯氏菌病的防治起到重要作用。