桑艷紅 郭玨函 焦培林

妊娠期糖尿?。╣estational diabetes mellitus，GDM）是孕產(chǎn)婦在妊娠期初次發(fā)生糖代謝異常的一種糖尿病，以多飲、多食、多尿為主要臨床表現(xiàn)，其發(fā)病率較高，可直接威脅母嬰健康［1］。目前，GDM 的發(fā)病機制尚未完全闡明，有關(guān)學者認為其與炎癥反應(yīng)、基因調(diào)控及胰島素抵抗（Insulin resistance，IR）密切相關(guān)［2］。研究顯示，微小RNA（microRNA，miRNA）與基因轉(zhuǎn)錄及表達有關(guān)，具有診治糖尿病類疾病的潛在價值［3］。有關(guān)研究顯示，miR-27a 是微小RNA-27（miRNA-27，miR-27）家族成員之一，在IR細胞中表達上調(diào)，有望成為治療糖尿病IR 的生物學靶標［4］。微小RNA-34c（miRNA-34c，miR-34c）在2型糖尿病患者中表達下調(diào)，其可能通過影響慢性應(yīng)激反應(yīng)，進而影響2 型糖尿病及IR 的發(fā)生發(fā)展［5］。IR 是GDM 發(fā)病的重要因素，臨床多以穩(wěn)態(tài)胰島素評價指數(shù)（homeostatic model assessment insulin resistance，HOMA-IR）評估IR 水平。孕婦胰島素抵抗性及敏感性有所變化，檢測HOMA-IR 有助于評估IR 及GDM［6］。本研究通過觀察GDM 患者血清外泌體miR-27、miR-34c 水平，分析其與IR 的相關(guān)性，以期為早期監(jiān)測GDM 提供參考依據(jù)。

1 一般資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年7月至2019年12月鄭州大學第五附屬醫(yī)院接收的158 例GDM 孕婦為GDM 組，納入標準：①患者均符合《妊娠合并糖尿病診治指南》有關(guān)GDM 相關(guān)診斷標準［7］；②患者均為單胎妊娠。排除標準：①合并全身感染性疾病、結(jié)締組織疾病、甲狀腺疾病、者；②合并心、肝、腎功能嚴重異常者；③合并惡性腫瘤、自身免疫性疾病、胎盤早剝及前置胎盤等危險妊娠情況者；④孕期使用影響糖代謝藥物者。選取同時間段內(nèi)本院162 例健康孕婦作為對照組。兩組孕婦知情同意研究，并簽署知情同意書，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準后實施。

1.2 主要試劑與儀器

TRIzol Reagent（貨號：J44580）購買于上海金穗生物科技有限公司；microRNA 提取試劑盒（貨號：845-KS-2030050）購買于北京金達陽光科技有限公司；miRNA QPCR Master Mix（貨號：600583）購買于上海嶸崴達實業(yè)有限公司。微量紫外可見分光光度計（型號：HY-Drop100）購買于輝因科技（北京）有限公司，實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR）儀（型號：QuantStudioTM12K Flex）購買于美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（上海），全自動生化分析儀（型號：BS-220）購買于上海恒舜天實業(yè)有限公司。

1.3 方法

收集兩組孕婦年齡、身高、體重、孕周、產(chǎn)次等信息，計算體重指數(shù)等資料。

1.3.1 樣本采集

收集兩組孕婦空腹靜脈血6～7 mL，置于無菌真空管中，均分成兩份。一份置于5 mL EP 管中，室溫靜置30～35 min，4 450 r/min 離心6 min，離心半徑10 cm，分離得上層血清，密封保存于-80℃冰箱中，用于miR-27、miR-34c 水平檢測；另一份用于檢測低密度脂蛋白（Low density lipoprotein，LDL）、空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BS）、三酰甘油（Triacylglycerol，TG）、及空腹胰島素（fasting insulin，F(xiàn)INS）、高密度脂蛋白（High density lipoprotein，HDL）水平。

1.3.2 qRT-PCR 法檢測血清中miR-27、miR-34c表達水平

從-80℃冰箱中取出適量血清樣本，冰上凍融，無菌條件下，采用TRIzol 法抽提血清樣本總RNA，利用紫外分光光度計檢測樣本總RNA 濃度、純度。按照microRNA 提取試劑盒操作說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)miRNA QPCR Master Mix 說明書將cDNA 進行擴增、PCR 檢測。miR-27、miR-34c均以U6為內(nèi)參，其對應(yīng)引物序列如表1所示。以2-ΔΔCT法計算miR-27、miR-34c 相對量。

表1 miR-27、miR-34c 及內(nèi)參基因U6 的引物序列Table 1 Primer sequences of miR-27，miR-34c and internal reference gene U6

1.3.3 血糖、血脂檢測

利用全自動生化分析儀檢測所有孕婦FBS、LDL、TG、HDL 水平，并采用化學發(fā)光法檢測兩組孕婦FINS 水平。利用穩(wěn)態(tài)胰島素評價指數(shù)（homeostatic model assessment insulin resistance，HOMA-IR）評估IR 程度，評估方法：HOMA-IR=FBS×FINS/22.5［8］。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 25.0 軟件進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)以（±s）表示，行獨立樣本t檢驗；采用Pearson 法分析GDM 孕婦血清miR-27、miR-34c 表達水平與HOMA-IR 的相關(guān)性；采用Logistic回歸分析GDM 發(fā)生的影響因素。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料及血脂水平比較

GDM 組孕婦體重指數(shù)、血清TG、LDL 及HDL水平較對照組高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），兩組年齡、產(chǎn)次、孕周比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 兩組一般資料及血脂水平比較（±s）Table 2 Comparison of general data and blood lipid levels between the two groups（±s）

表2 兩組一般資料及血脂水平比較（±s）Table 2 Comparison of general data and blood lipid levels between the two groups（±s）

組別對照組GDM 組t 值P 值n 162 158年齡（歲）29.96±5.72 29.85±5.57 0.174 0.862孕周（周）26.57±1.60 26.43±1.52 0.802 0.423 TG（mmol/L）1.78±0.77 3.76±1.46 15.472＜0.001體重指數(shù)（kg/m2）21.42±2.23 24.55±2.37 12.170＜0.001 LDL（mmol/L）2.51±1.06 3.23±1.82 4.337＜0.001產(chǎn)次（次）1.81±0.73 1.76±0.68 0.634 0.527 HDL（mmol/L）1.54±0.62 1.99±0.78 5.720＜0.001

2.2 兩組孕婦血清miR-27、miR-34c 表達水平比較

GDM 組孕婦血清miR-27 表達水平明顯比對照組高，miR-34c 表達水平明顯比對照組低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 兩組孕婦血清miR-27、miR-34c 表達水平比較（±s）Table 3 Comparison of serum miR-27 and miR-34cexpression levels between the two groups of pregnant women（±s）

表3 兩組孕婦血清miR-27、miR-34c 表達水平比較（±s）Table 3 Comparison of serum miR-27 and miR-34cexpression levels between the two groups of pregnant women（±s）

組別對照組GDM 組t 值P 值n 162 158 miR-27 1.02±0.33 1.67±0.58 12.360＜0.001 miR-34c 1.04±0.34 0.62±0.27 12.218＜0.001

2.3 兩組孕婦胰島素抵抗相關(guān)指標比較

GDM 組孕婦FBS、FINS 和HOMA-IR 水平均明顯比對照組高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表4。

表4 兩組孕婦FBS、FINS 及HOMA-IR 水平比較（±s）Table 4 Comparison of FBS，F(xiàn)INS and HOMA-IR levels between the two groups of pregnant women（±s）

表4 兩組孕婦FBS、FINS 及HOMA-IR 水平比較（±s）Table 4 Comparison of FBS，F(xiàn)INS and HOMA-IR levels between the two groups of pregnant women（±s）

組別對照組GDM 組t 值P 值n 162 158 FBS（mmol/L）4.96±1.35 5.64±1.78 3.856＜0.001 FINS（mIU/L）6.83±2.32 11.26±4.07 11.999＜0.001 HOMA-IR 1.52±0.62 2.80±1.02 13.603＜0.001

2.4 GDM 孕婦血清miR-27、miR-34c 表達水平與HOMA-IR 的相關(guān)性分析

Pearson 法相關(guān)性分析顯示，GDM 患者血清miR-27 表達水平與HOMA-IR 水平呈正相關(guān)（r=0.455，P＜0.05），血清miR-34c 表達水平與HOMA-IR水平呈負相關(guān)（r=-0.425，P＜0.05）。

2.5 影響GDM 的Logistic 回歸分析

以GDM 是否發(fā)生為因變量（是=1，否=2），以體重指數(shù)、TG、LDL、HDL、miR-27、miR-34c、FBS、FINS 及HOMA-IR 水平為自變量，行Logistic 回歸分析，結(jié)果顯示，體重指數(shù)、TG、miR-27、HOMA-IR是影響GDM 發(fā)生的危險因素（P＜0.05），miR-34c是影響GDM 發(fā)生的保護因素（P＜0.05）。見表5。

表5 Logistic 回歸分析GDM 發(fā)生的影響因素Table 5 Logistic regression analysis of factors affecting the occurrence of GDM

3 討論

GDM 發(fā)病率較高，可導致產(chǎn)婦發(fā)生流產(chǎn)、羊水過多、感染，增加巨大兒、極低體重兒、胎兒畸形、新生兒呼吸窘迫綜合癥、新生兒低血糖等發(fā)生率，對產(chǎn)婦及圍產(chǎn)兒生命健康構(gòu)成極大威脅［9］。本研究顯示，GDM 孕婦體重指數(shù)、血清TG、LDL 及HDL 水平較高，與陳年芳等［10］研究一致，提示GDM可能與體重指數(shù)、血脂異常有關(guān)，臨床應(yīng)及時監(jiān)控女性體重指數(shù)、血脂水平，預防GDM 發(fā)生。

miRNA 可調(diào)控炎癥反應(yīng)、慢性應(yīng)激、信號傳導等生物學過程，其可能是糖尿病、糖尿病腎病、糖尿病視網(wǎng)膜病變、GDM 等的診治靶標［11］。既往研究顯示，miR-27 是miRNA 成員之一，其在高脂飲食誘導的肥胖小鼠中表達異常，經(jīng)類黃酮衍生物治療后，miR-27 表達發(fā)生改變，其可能參與肥胖、糖尿病發(fā)生發(fā)展［12］。本研究中GDM 組孕婦血清miR-27表達水平明顯高于對照組，提示miR-27 可能在GDM 病理發(fā)展中發(fā)揮重要作用。推測可能原因，miR-27 作為miRNA 成員之一，其可能通過影響慢性應(yīng)激及胰島素信號傳導過程，從而影響GDM 發(fā)生發(fā)展。體外研究顯示，高葡萄糖處理足細胞后，miR-34c 表達下調(diào)；miR-34c 可通過靶向調(diào)節(jié)有關(guān)蛋白表達，進而影響糖尿病性腎病的發(fā)展過程，有望成為治療糖尿病性腎病的靶標［13］。另有研究顯示，miR-34c 在1 型糖尿病中表達失調(diào)，其可能通過調(diào)控自噬過程，從而參與糖尿病角膜病變［14］。以上研究表明，異常表達的miR-34c 可能與糖尿病類疾病相關(guān)。此外，Bai 等［15］研究發(fā)現(xiàn)miR-34c 通過調(diào)節(jié)靶標表達，從而影響胰島素合成及分泌，miR-34c 具有治療糖尿病的潛在價值。本研究通過比較GDM組及對照組孕婦血清miR-34c 水平，結(jié)果顯示，GDM組孕婦血清miR-34c 水平明顯低于對照組，提示miR-34c 可能參與并影響GDM 疾病進程。

IR 是由多種因素引起胰島素對葡萄糖攝取及利用率降低的一種狀態(tài)，其可引發(fā)2 型糖尿病、代謝綜合征、GDM［16］。研究顯示，GDM 患者FBS、FINS 及HOMA-IR 水平均呈高水平，GDM 孕婦對胰島素敏感性及抵抗性降低，HOMA-IR 是GDM發(fā)病的危險因素［17］。Tanaka 等［18］發(fā)現(xiàn)GDM 孕婦HOMA-IR 水平明顯上調(diào)，孕婦IR 可能是影響肥胖和胎盤大小、功能的重要因素。以上研究表明，HOMA-IR 水平異?？赡芘cGDM 發(fā)病有關(guān)。本研究顯示，GDM 患者FBS、FINS 和HOMA-IR 水平均明顯高于對照組，與譚晶等［17］研究結(jié)果相符，提示GDM 發(fā)展過程可能與IR 異常關(guān)系緊密。

本研究中GDM 患者血清miR-27 表達水平與HOMA-IR呈正相關(guān)，miR-34c表達水平與HOMA-IR呈負相關(guān)，提示miR-27、miR-34c 與IR 相互影響，從而共同影響GDM 疾病發(fā)生發(fā)展。進一步研究顯示，體重指數(shù)、TG、miR-27、HOMA-IR 是影響GDM 發(fā)生的危險因素，miR-34c是影響GDM發(fā)生的保護因素。

綜上所述，GDM 患者血清miR-27 表達升高，miR-34c 表達降低，miR-27、miR-34c 水平與IR 顯著相關(guān)，兩者可能與IR 相互作用，從而在GDM 發(fā)展中起作用。