朱會宇

(河南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,鄭州 450000)

所有生物過程都伴隨著能量代謝,細(xì)胞內(nèi)的能量供應(yīng)主要依賴于線粒體合成的三磷酸腺苷(ATP)[1-2]。因此,建立有效的細(xì)胞內(nèi)ATP及其代謝產(chǎn)物[二磷酸腺苷(ADP)和一磷酸腺苷(AMP)]的定量方法是非常有必要的。ATP、ADP 和AMP的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)非常相似,同時(shí)測定會有一定困難。目前,相關(guān)分析方法主要有熒光法[3]、電化學(xué)法[4]、生物傳感器[5]、電化學(xué)生物傳感器[6-7]、高效液相色譜法[8-10]、化學(xué)發(fā)光法[11-13]以及核磁共振波譜法[14],但這些方法不能同時(shí)測定ATP及其代謝物,且分析時(shí)間長、系統(tǒng)不穩(wěn)定、細(xì)胞內(nèi)小分子雜質(zhì)干擾大。鑒于此,本工作開發(fā)了一種穩(wěn)定、可靠且可同時(shí)測定細(xì)胞內(nèi)ATP 及其代謝物含量的方法,并取得了滿意結(jié)果。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

島津LC-20A 型高效液相色譜系統(tǒng);Pall OD003C34型超濾管;Gibico含谷氨酸RPMI-1640培養(yǎng)基;血球細(xì)胞計(jì)數(shù)板;Thermo Fisher Sorvall Micro 17&21型離心機(jī)。

單標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:10 mmol·L－1,取適量ATP、ADP、AMP標(biāo)準(zhǔn)品,用水溶解和稀釋,搖勻備用。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列:取適量上述單標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,用水逐級稀釋,配制成0.1,0.5,2,4,10,20,40,80,100μmol·L－1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。

磷酸鹽緩沖溶液:pH 7.2～7.4。

ATP、ADP、AMP標(biāo)準(zhǔn)品的純度分別為99%,98%,99%。磷酸氫二鈉、甲醇為色譜純;其他所用試劑均為分析純;試驗(yàn)用水為超純水,使用前過0.22μm 濾膜。

1.2 色譜條件

Angela Venusil MP C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm)。流動相為體積比為96∶4 的含50 mmol·L－1磷酸氫二鈉和15 mmol·L－1三乙胺的水溶液(用乙酸調(diào)節(jié)酸度至pH 7.88)、甲醇的混合溶液;等度洗脫;流量0.8 mL·min－1;進(jìn)樣量20μL;檢測波長254 nm。

1.3 試驗(yàn)方法

在培養(yǎng)基中加入人膀胱癌T24 細(xì)胞1 mL、100 g·L－1鏈霉素溶液5.5 mL、胎 牛血清溶 液55 mL、100 U·m L－1青霉素溶液5.5 mL,在5%(體積分?jǐn)?shù))二氧化碳(底氣為氧氣)環(huán)境中于37 ℃培養(yǎng)2 d,用血球細(xì)胞計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)。用冷磷酸鹽緩沖液(pH 7.2～7.4)清洗兩次,在其中加入80%(體積分?jǐn)?shù))冷甲醇溶液500μL,在冰上放置5 min,用于裂解細(xì)胞,釋放3 種目標(biāo)物。以12 000 r·min－1轉(zhuǎn)速離心10 min,上清液置于超濾裝置中,于4 ℃以13 500 r·min－1轉(zhuǎn)速離心15 min。分 取240μL濾液,加入50 mmol·L－1磷酸氫二鈉和15 mmol·L－1三乙胺的混合溶液(用乙酸調(diào)節(jié)酸度至pH 7.88)240μL,所得樣品溶液供高效液相色譜儀分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜行為

按照試驗(yàn)方法分析樣品溶液和10μmol·L－1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,結(jié)果見圖1。

圖1 樣品溶液和混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig.1 Chromatograms of sample solution and mixed standard solution

結(jié)果顯示:3種目標(biāo)物色譜峰峰形及分離效果(分離度為1.5和1.3)均較好,ATP、ADP、AMP的保留時(shí)間分別為15.55,16.81,14.03 min;樣品溶液中雜質(zhì)幾乎在AMP前出峰,對3種目標(biāo)物干擾較小。

2.2 色譜條件的選擇

試驗(yàn)考察了流動相中的磷酸鹽分別為磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉,胺類物質(zhì)分別為二乙胺、三甲胺、三乙胺時(shí)對3種目標(biāo)物測定的影響。結(jié)果顯示,當(dāng)磷酸鹽選用磷酸氫二鈉,胺類物質(zhì)選用三乙胺時(shí),分離度大于1.5,測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD,n＝7)不大于5.0%,滿足分析要求。因此,試驗(yàn)選擇磷酸氫二鈉和三乙胺配制流動相。

試驗(yàn)還考察了流動相中甲醇體積分?jǐn)?shù)分別為2%,4%,6%時(shí)對3種目標(biāo)物測定的影響。結(jié)果顯示:當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)為2%時(shí),ATP 和AMP不能有效分離;當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)為6%時(shí),3種目標(biāo)物均不能有效分離;甲醇體積分?jǐn)?shù)為4%時(shí),3種目標(biāo)物的分離效果均較好,因此試驗(yàn)選擇以此體積分?jǐn)?shù)配制流動相。

試驗(yàn)用乙酸調(diào)節(jié)水相的酸度,并考察了酸度分別為pH 6.08,7.03,7.88時(shí)對測定的影響。結(jié)果顯示:當(dāng)酸度為pH 7.03時(shí),3種目標(biāo)物均不能有效地分離;當(dāng)酸度為pH 6.08 時(shí),AMP和ATP的分離度(0.9)較差;當(dāng)酸度為pH 7.88時(shí),3種目標(biāo)物峰形以及分離效果較好。因此,試驗(yàn)選擇將水相的酸度調(diào)節(jié)至pH 7.88。

試驗(yàn)進(jìn)一步考察了流量分別為0.6,0.8,1.0 mL·min－1時(shí)對3種目標(biāo)物測定的影響。結(jié)果顯示:當(dāng)流量為0.6 mL·min－1時(shí),3種目標(biāo)物分離效果較好,但分析時(shí)間過長;當(dāng)流量為1.0 mL·min－1時(shí),3 種目標(biāo)物均不能有效分離;當(dāng)流量為0.8 mL·min－1時(shí),分離度和分析時(shí)間均滿足要求。因此,試驗(yàn)選擇以0.8 mL·min－1流量進(jìn)行后續(xù)分析。在優(yōu)化的色譜條件下,分析時(shí)間可縮短至30 min內(nèi)。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

按照儀器工作條件分析混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,以3種目標(biāo)物的濃度為橫坐標(biāo),以其對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,所得標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍均為0.1～100μmol·L－1,其他線性參數(shù)見表1。

表1 線性參數(shù)Tab.1 Linearity parameters

分別以不小于3倍信噪比對應(yīng)的濃度作為檢出限,所得檢出限均為0.005μmol·L－1。

2.4 精密度和回收試驗(yàn)

按照色譜條件重復(fù)測定10μmol·L－1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液5 次,計(jì)算測定值的RSD,ATP、ADP 和AMP所得結(jié)果分別為4.4%,2.6%,3.8%,表明儀器精密度較好。

按照試驗(yàn)方法對實(shí)際樣品進(jìn)行3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn),每個(gè)濃度水平平行測定5次,計(jì)算回收率和測定值的RSD,所得結(jié)果見表2。

表2 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n=5)Tab.2 Results of tests for precision and recovery(n=5)

由表2可知,3種目標(biāo)物的回收率為82.2%～87.7%,測定值的RSD 為2.0%～4.9%。

2.5 樣品分析

按照試驗(yàn)方法分析實(shí)際樣品,所得細(xì)胞數(shù)為2×107,ATP、ADP 和AMP的檢出量分別4.593,0.508,0.147 nmol。

2.6 孵育溫度對細(xì)胞中ATP、ADP和AMP含量的影響

人膀胱癌T24 細(xì)胞在培養(yǎng)24 h 后,又分別在4,37 ℃下孵育2.5 h,按照試驗(yàn)方法測定4,37 ℃下細(xì)胞樣品(記為T-4和T-37)中ATP、ADP和AMP含量,血球細(xì)胞計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)為106,3種目標(biāo)物含量見圖2。

圖2 孵育溫度對細(xì)胞中ATP、ADP和AMP含量的影響Fig.2 Effect of incubation temperature on the contents of ATP,ADP and AMP in cells

由圖2可知,ATP、ADP和AMP含量受溫度調(diào)節(jié),孵育溫度與細(xì)胞內(nèi)ATP 含量呈負(fù)相關(guān),與ADP與AMP呈正相關(guān),這與文獻(xiàn)[15]的研究結(jié)果一致,進(jìn)一步說明本方法可靠。

本工作以反相高效液相色譜法測定人膀胱癌T24細(xì)胞中ATP、ADP 和AMP 的含量,該方法穩(wěn)定性好、線性范圍寬、檢出限低、檢測快速、樣品量少、操作簡單,可為細(xì)胞內(nèi)能量代謝物的研究提供參考。