張文華，胡起立，侯建波，毛壬熠，徐 可，王良莉，謝 文，徐敦明，沈偉健

(1.杭州海關(guān)技術(shù)中心,杭州 310016; 2.浙江省檢驗檢疫科學(xué)技術(shù)研究院,杭州 310016;3.廈門海關(guān)技術(shù)中心,廈門 361013; 4.南京海關(guān)動植物與食品檢測中心,南京 210019)

氟苯尼考(FF)又稱氟甲砜霉素,是一種新型的氯霉素類動物專用抗生素,主要代謝產(chǎn)物為氟苯尼考胺(FFA)[1-2],具有抗菌譜廣、高效、安全等特點,在防治畜禽養(yǎng)殖過程中的細(xì)菌性疾病方面有廣泛應(yīng)用[3-4]。氟苯尼考在畜禽動物體內(nèi)的半衰期長、分布較廣,人長期食用氟苯尼考?xì)埩袅砍瑯?biāo)的畜禽產(chǎn)品,可能產(chǎn)生頭暈、嘔吐、腹瀉、過敏等癥狀。氟苯尼考存在兩種對映體[5],分別為(－)-氟苯尼考左旋體[(－)-FF]和(＋)-氟苯尼考右旋體[(＋)-FF]。其中(－)-氟苯尼考左旋體具有抗菌活性,而(＋)-氟苯尼考右旋體無活性甚至對(－)-氟苯尼考的活性有一定抑制作用[6-8]。GB 31650－2019[9]只規(guī)定豬肉中氟苯尼考及其代謝物氟苯尼考胺總殘留限量為300μg·kg－1,并未單獨規(guī)定對映體及代謝物的殘留量。如果能進一步研究氟苯尼考的兩種對映體及其代謝物氟苯尼考胺在豬肉中的殘留量,將為氟苯尼考對映體殘留分析提供更精準(zhǔn)的判定。

目前國內(nèi)外檢測氟苯尼考對映體的方法主要為高效液相色譜法[7-8,10-12]。該方法分離度好,但存在檢測時間較長、有機試劑消耗量大等問題,無法實現(xiàn)樣品的快速分離檢測。因此,開發(fā)一種快速、高效的檢測方法具有廣泛的應(yīng)用前景。超高效合相色譜法(UPC2)主要以超臨界狀態(tài)的二氧化碳為流動相主體,加入少量甲醇、乙腈、異丙醇等助溶劑,通過調(diào)節(jié)柱溫、系統(tǒng)背壓及助溶劑的比例來改變二氧化碳的密度和洗脫能力,從而精確調(diào)控目標(biāo)化合物的分離,該方法對結(jié)構(gòu)相似的手性化合物具有很好的分離效果[13-17],但還未見其在氟苯尼考對映體的分離及殘留量測定分析中的報道。鑒于此,本工作開發(fā)了UPC2分離和測定兩種氟苯尼考對映體及其代謝物氟苯尼考胺含量的方法,并應(yīng)用于豬肉中氟苯尼考及其代謝物的分離和殘留量的測定,以期為畜禽類產(chǎn)品中的氟苯尼考對映體及代謝物殘留測定提供技術(shù)支持。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Acquity型超高效合相色譜儀;AE260 型電子天平;R215 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;ELGA CLXXXUVM2型超純水凈化系統(tǒng);MS2 型渦旋混勻器;NEVAPTM 111 型氮吹儀;Oasis HLB 固相萃取柱(3 mL,60 mg)。

單標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:1.0 g·L－1,取兩種氟苯尼考對映體和氟苯尼考胺標(biāo)準(zhǔn)品各0.01 g(精確至0.1 mg),用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列:取一定量的兩種氟苯尼考對映體和氟苯尼考胺的單標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,用體積比8∶2的正庚烷-異丙醇混合溶液逐級稀釋,配制成0.50,1.00,2.00,4.00,10.00,20.00 mg·L－1的 混 合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。

磷酸鹽緩沖溶液:pH 6.0,取8.00 g磷酸氫二鉀和2.00 g磷酸二氫鉀,用水溶解并定容至1 L 容量瓶中。

氟苯尼考胺標(biāo)準(zhǔn)品的純度不小于99.7%;(－)-氟苯尼考和(＋)-氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品的純度不小于99.0%。

乙腈、甲醇、乙醇、異丙醇、正庚烷、乙酸乙酯均為色譜純;氨水、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀均為分析純;二氧化碳純度為99.999%;其他所用試劑均為分析純;試驗用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

CHIRALPAK AD-3 手性色譜柱(150 mm×3.0 mm,3μm),填料為直鏈淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯);檢測波長224 nm;系統(tǒng)背壓13.8 MPa;柱溫40 ℃;流動相A為二氧化碳,B 為含0.5%(體積分?jǐn)?shù),下同)氨水的甲醇溶液;梯度洗脫程序:0～2.0 min時,B為10%;2.0～3.0 min時,B 由10%升至25%,保持3.0 min;6.0～6.1 min時,B 由25% 跳轉(zhuǎn)至10%,保持2.0 min。流量1.0 mL·min－1;進樣量5.0μL。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的提取

取10.0 g(精確至0.01 g)豬肉樣品置于50 mL具塞離心管中,加入25 mL含3%(體積分?jǐn)?shù),下同)氨水的乙酸乙酯溶液,渦旋1 min混勻,在3 000 r·min－1轉(zhuǎn)速下離心5 min,吸取上清液至濃縮瓶中,以25 mL含3%氨水的乙酸乙酯溶液重復(fù)提取一次。合并兩次上清液,于40℃水浴中減壓濃縮至近干,加入10 mL 磷酸鹽緩沖溶液分次溶解殘渣,待凈化。

1.3.2 樣品的凈化和測定

這一點顯而易見，毋庸多言。閱讀原汁原味的軍事名著在語言上也會一種修煉提高。很多世界軍事名著都是以英語呈現(xiàn)的，通過閱讀這些軍事名著，真正了解其內(nèi)涵，學(xué)員的英語閱讀、理解及表達能力都會有所提高。而對于原著不是以英語呈現(xiàn)的世界軍事名著，可以將其通行英譯本及中譯本對照閱讀。對照閱讀有助于學(xué)員發(fā)現(xiàn)譯者理解上的不同，從而更加能動地參與閱讀、加深理解。

依次用3mL甲醇、3mL水活化HLB 固相萃取柱。將上述待凈化溶液注入活化好的HLB 固相萃取柱中,用10 mL水淋洗,棄去淋洗液,真空抽柱1 min,用6 mL甲醇洗脫,洗脫液收集在15 mL 離心管中,于40℃氮吹至近干,加入1 mL體積比8∶2的正庚烷-異丙醇混合溶液,渦旋3 min充分溶解殘渣,過0.22μm 有機濾膜,濾液供UPC2分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取試劑的選擇

文獻報道的氟苯尼考及其代謝物氟苯尼考胺的提取試劑通常為乙酸乙酯[18-20]、水-丙酮混合溶液[21]、乙腈[22-23]、甲醇[24]等,因此試驗比較了這幾種試劑的提取效果。結(jié)果顯示:采用水-丙酮混合溶液、乙腈或甲醇提取時,典型目標(biāo)物氟苯尼考胺的回收率分別為71.3%,75.7%,53.2%;采用乙酸乙酯提取時,氟苯尼考胺的回收率為76.9%,提取效果相對較好。氟苯尼考胺為弱堿性物質(zhì),為增加其提取率,試驗選擇在乙酸乙酯中加入適量氨水,當(dāng)氨水的體積分?jǐn)?shù)為3%時,氟苯尼考胺的回收率為95.4%,且其色譜峰附近的干擾峰較少。因此,試驗選擇含3%氨水的乙酸乙酯溶液作為提取試劑。

2.2 固相萃取柱的選擇

試驗考察了Oasis HLB 混合型陽離子交換固相萃取柱(3 mL,60 mg)、親水親脂Oasis HLB 固相萃取柱(6 mL,200 mg)和非極性疏水Supleco C18固相萃取柱(3 mL,500 mg)對豬肉中氟苯尼考及其代謝物凈化效果的影響。結(jié)果表明:與MCX 固相萃取柱相比,采用C18或HLB固相萃取柱凈化后的色譜圖中目標(biāo)化合物色譜峰附近的干擾峰較少;采用3種固相萃取柱凈化后,3種目標(biāo)化合物的回收率依次為32.8%,97.7%,80.1%,HLB 固相萃取柱所得結(jié)果的準(zhǔn)確度較高。因此,試驗選擇HLB 固相萃取柱對樣品進行凈化。

2.3 定容試劑的選擇

試驗比較了5 種常用定容試劑甲醇、乙醇、乙腈、異丙醇、正庚烷對兩種氟苯尼考對映體和氟苯尼考胺分離效果的影響。結(jié)果顯示:在5種定容試劑中,正庚烷所得兩種氟苯尼考對映體的色譜分離度和響應(yīng)情況較好,異丙醇所得氟苯尼考胺的色譜響應(yīng)情況較好。

為了保證兩種氟苯尼考對映體和氟苯尼考胺具有良好的色譜分離及響應(yīng)效果,試驗選擇以正庚烷-異丙醇混合溶液作定容試劑,并考察了不同體積比正庚烷-異丙醇的混合溶液對3種目標(biāo)化合物分離效果的影響,見圖1。

圖1 正庚烷-異丙醇的體積比對(＋)-氟苯尼考、(－)-氟苯尼考和氟苯尼考胺分離效果的影響Fig.1 Effect of volume ratio of n-heptane to isopropanol on the separation of(＋)-florfenicol,(－)-florfenicol and florfenicol amine

由圖1可知:混合溶液中正庚烷的占比越高,(－)-氟苯尼考的峰形越尖銳;異丙醇的占比越高,氟苯尼考胺的峰形越尖銳。綜合考慮3種目標(biāo)化合物的峰形,試驗選擇體積比8∶2的正庚烷-異丙醇混合溶液作為定容試劑。

2.4 系統(tǒng)背壓的選擇

在UPC2分析中,常通過調(diào)節(jié)系統(tǒng)背壓來控制二氧化碳在儀器運行過程中的超臨界狀態(tài),從而改變其對物質(zhì)的洗脫能力、溶解能力和選擇性。由于二氧化碳在壓力超過7.38 MPa、溫度不小于31 ℃時才會進入超臨狀態(tài),因此試驗在此基礎(chǔ)上,考察了系統(tǒng)背壓分別為10.3,13.8,17.2,20.7,24.1 MPa時對目標(biāo)化合物分離效果的影響。結(jié)果表明,隨著系統(tǒng)背壓的增加,3種目標(biāo)化合物的分析時間逐漸縮短,(－)-氟苯尼考峰高逐漸降低,(＋)-氟苯尼考和氟苯尼考胺的色譜峰高逐漸升高。綜合考慮色譜峰形、峰高、保留時間等因素,試驗選擇的系統(tǒng)背壓為13.8 MPa。

2.5 柱溫的選擇

在UPC2分析中,柱溫對目標(biāo)化合物的保留時間和分離度有一定影響,當(dāng)柱溫升高,超臨界二氧化碳流體的密度發(fā)生改變,流動相黏度減小,目標(biāo)化合物的洗脫能力也隨之降低,保留時間相應(yīng)延長。以CHIRALPAK AD-3 手性色譜柱的最高使用溫度(40 ℃)和二氧化碳進入超臨界狀態(tài)的最低溫度(31 ℃)為限值,試驗考察了柱溫分別為31,35,40 ℃對3 種目標(biāo)化合物分離效果的影響,如圖2所示。

由圖2可知:當(dāng)柱溫為31 ℃和35 ℃時,3 種目標(biāo)化合物中只有(－)-氟苯尼考得到完全分離,(＋)-氟苯尼考和氟苯尼考胺的色譜峰未能實現(xiàn)完全分離;當(dāng)柱溫達到40 ℃時,3種目標(biāo)化合物完全分離,且峰形良好。因此,試驗選擇的色譜柱柱溫為40 ℃。

圖2 柱溫對(＋)-氟苯尼考、(－)-氟苯尼考和氟苯尼考胺分離效果的影響Fig.2 Effect of column temperature on the separation of(＋)-florfenicol,(－)-florfenicol and florfenicol amine

2.6 色譜行為

按照儀器工作條件分析混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,如圖3所示。

圖3 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig.3 Chromatogram of the mixed standard solution

由圖3可知,(－)-氟苯尼考、(＋)-氟苯尼考和氟苯尼考胺的分離效果良好,在5.0 min內(nèi)全部實現(xiàn)了有效分離,分離度分別為4.0 和1.8,均大于1.5,符合完全分離的要求[25]。

2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線和測定下限

按照儀器工作條件分析混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,以3種目標(biāo)化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),其對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示,3種目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍均為0.50～20.00 mg·L－1,線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表1。

以陰性豬肉樣品加標(biāo)的方法進行試驗,以不小于10倍信噪比對應(yīng)的含量作為測定下限,所得結(jié)果見表1。

表1 線性參數(shù)和測定下限Tab.1 Linearity parameters and lower limits of determination

2.8 精密度和回收試驗

按照試驗方法對陰性豬肉樣品進行3個濃度水平的加標(biāo)回收試驗,每個濃度水平平行測定6次,計算回收率和測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表2。

表2 精密度和回收試驗結(jié)果(n=6)Tab.2 Results of tests for precision and recovery(n=6)

由表2 可知,3 種目標(biāo)化合物的回收率為81.2%～107%,測定值的RSD為5.0%～9.0%,回收率和精密度符合GB/T 27404－2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》[26]的要求,能夠滿足豬肉樣品的分析要求,可用于日常分析檢測。

2.9 樣品分析

按照試驗方法分析20份市售豬肉樣品。結(jié)果顯示,20 份豬肉樣品中均未檢出(＋)-氟苯尼考,1份豬肉樣品中檢出(－)-氟苯尼考(248 μg·kg－1),與文獻[8,11,13]采用HPLC分析氟苯尼考樣品所得的結(jié)論相符,即供試品中的氟苯尼考主要為(－)-氟苯尼考。

本工作采用UPC2分離氟苯尼考對映體和氟苯尼考胺,并對豬肉中氟苯尼考對映體和氟苯尼考胺的殘留量進行測定。使用氨化乙酸乙酯對樣品進行提取,通過HLB固相萃取柱對樣品進行凈化后,采用CHIRALPAK AD-3手性色譜柱分離,以超臨界二氧化碳和含0.5%氨水的甲醇溶液為流動相進行梯度洗脫,外標(biāo)法定量,方法精密度和準(zhǔn)確度均較好,可用于豬肉中相關(guān)物質(zhì)的檢測。