陳顯柳，謝德芳，陳博鈺，韓丙軍

(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測試中心 國家市場監(jiān)管重點實驗室(熱帶果蔬質(zhì)量與安全)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部亞熱帶果品蔬菜質(zhì)量安全控制重點實驗室 海南省熱帶果蔬產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室,?？?571101)

喹啉銅是一種廣譜、高效、低殘留的喹啉類低毒殺菌劑,屬于有機銅鰲合物,同時具有喹啉和銅鹽的效用,主要用于防治柑橘的潰瘍病、馬鈴薯的早疫病、黃瓜的霜霉病、楊梅樹的褐斑病等植物病害,對水果、蔬菜的細菌、真菌性病害均具有良好的預(yù)防和治療作用。農(nóng)作物在噴施喹啉銅后,其表面可形成一層嚴密的保護藥膜,藥膜會緩慢釋放銅離子,被萌發(fā)的細菌孢子吸收,吸收至一定濃度水平時,孢子細胞即可被殺死,從而有效抑制病菌的萌發(fā)和侵入,達到防病治病的目的[1-2]。目前,國內(nèi)登記在冊的喹啉銅農(nóng)藥產(chǎn)品有31 種,包括原藥、可濕性粉劑、懸浮劑、水分散粒劑,主要登記在冊的農(nóng)作物有柑橘、番茄、葡萄、辣椒、黃瓜、馬鈴薯、蘋果和梨等。隨著國家對食品安全的重視,高效、低毒的喹啉銅將得到更多市場推廣應(yīng)用,由此可能產(chǎn)生相關(guān)產(chǎn)品的過量使用。過量使用喹啉銅不僅會造成環(huán)境污染,還會導(dǎo)致銅離子在生物體內(nèi)富集,進而對人體健康產(chǎn)生威脅。當(dāng)前只有日本規(guī)定了喹啉銅在柑橘中的殘留限量(5 mg·kg－1),而中國[3]、國際食品法典委員會(CAC)和歐盟均未對此進行相關(guān)規(guī)定。在此背景下,有必要開發(fā)快速準確地測定農(nóng)作物中喹啉銅農(nóng)藥殘留量的方法,為喹啉銅殘留風(fēng)險分析評價和農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管提供技術(shù)手段。

農(nóng)作物中喹啉銅農(nóng)藥殘留量的測定方法主要為氣相色譜法[4-5]、液相色譜法[6-14]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[15]。氣相色譜法前處理操作復(fù)雜,易導(dǎo)致喹啉銅損耗,且時間和試劑消耗過大,不適合大批量樣品的處理。液相色譜法為使用較多的方法,如文獻[4]在酸性條件下,用乙二胺四乙酸(EDTA)溶液將喹啉銅轉(zhuǎn)化為8-羥基喹啉,再通過附火焰熱離子檢測器(FTD)的氣相色譜法測定其含量。文獻[6]采用乙腈和鹽酸提取和凈化稻田水、土壤和水稻樣品,以添加了十二烷基硫酸鈉和磷酸二氫鈉的流動相進行洗脫,以高效液相色譜法(HPLC)測定喹啉銅的殘留量。文獻[7]簡化了前處理流程,使用PCX 混合陽離子交換固相萃取柱富集西瓜中的喹啉銅,再以超高效液相色譜法測定其含量。文獻[8]采用分散固相萃取法富集和凈化,以含十二烷基硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液-乙腈作為流動相進行梯度洗脫,以液相色譜法測定黃瓜中喹啉銅的殘留量?？梢钥闯?液相色譜法多采用含十二烷基硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液作流動相,若長期使用該流動相,可能造成色譜柱和色譜系統(tǒng)的損傷,測試成本較高。

柑橘可作為水果食用,也可制成藥物入藥,但目前還未發(fā)現(xiàn)柑橘樣品中喹啉銅殘留量分析的相關(guān)研究。鑒于此,本工作以體積比為1∶9的0.1%(體積分數(shù),下同)三氟乙酸溶液和乙腈的混合溶液作為提取劑和流動相,以石墨化碳黑(GCB)作為凈化填料分離基質(zhì),以HPLC 測定柑橘全果、橘肉和橘皮中喹啉銅的殘留量。該方法前處理過程簡單、準確度高、重現(xiàn)性好、分析時間短,可為柑橘中喹啉銅農(nóng)藥殘留的研究提供科學(xué)的方法參考。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Waters e2695型高效液相色譜儀,配2489型紫外檢測器;CR22N 型臺式高速冷凍離心機;RV8型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;Milli-Q 型超純水機;XW-80A 型微型渦旋混合儀;T25型植物組織搗碎機;TTL-DCII型氮吹儀。

喹啉銅標準儲備溶液:100 mg·L－1,取10 mg喹啉銅,用流動相超聲溶解并定容至100 mL,搖勻備用。

喹啉銅標準溶液系列:取適量喹啉銅標準儲備溶液,用流動相逐級稀釋,配制成0.1,0.2,0.5,1.0,5.0 mg·L－1標準溶液系列,于4 ℃避光保存。

喹啉銅標準品的純度為99.8%;乙腈、三氟乙酸為色譜純;試驗用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

Sun Fire?C18色 譜 柱(150 mm×4.6 mm,5μm);柱溫25 ℃;流動相為體積比為1∶9 的0.1%三氟乙酸溶液和乙腈的混合溶液;等度洗脫;流量1.0 mL·min－1;進樣量10μL;檢測波長254 nm。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的采集和制備

1)柑橘全果樣品 從4株柑橘樹不同朝向的上、中、下、里、外等部位隨機采集不少于12個果實,果實質(zhì)量在2 kg以上,且生長正常、無病害。沿縱向?qū)⒐麑嵕鶆蚯谐?～8瓣(雙數(shù)),分取不相鄰的2～4瓣,放入植物組織搗碎機中進行勻漿。四分法縮分,分取150 g樣品兩份,分別裝入樣品容器中,貼好標簽,貯存于－20 ℃冰柜中。

2)柑橘橘肉、橘皮樣品 以上述方法采集并切開樣品,分取不相鄰的2～4瓣,分離柑橘橘肉和橘皮。將橘皮切成約2 cm×2 cm 的小塊,放入植物組織搗碎機中勻漿,分取150 g樣品兩份,分別裝入樣品容器中,貼好標簽,貯存于－20 ℃冰柜中。用植物組織搗碎機對橘肉進行勻漿,分取150 g樣品兩份,分別裝入樣品容器中,貼好標簽,貯存于－20 ℃冰柜中。

1.3.2 樣品的前處理和測定

稱取5.00 g 柑橘全果、橘肉或橘皮樣品于50 mL離心管中,加入3 g氯化鈉和流動相10 mL,渦旋5 min,超聲20 min,以3 800 r·min－1轉(zhuǎn)速離心5 min,重復(fù)提取一次。合并上清液,分取5 mL于10 mL 離心管中,加入5 mg GCB 填料,渦旋2 min,以3 800 r·min－1轉(zhuǎn)速離心5 min。分取4 mL上清液,于60 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干,用流動相1 mL復(fù)溶,過0.22μm 水相濾膜,濾液按照儀器工作條件測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取劑的選擇

柑橘中含有豐富的黃酮類化合物、甘油糖脂、萜類化合物等,樣品基質(zhì)復(fù)雜。在選擇提取劑時,首先嘗試以乙腈作提取劑,但是所得喹啉銅色譜峰附近有雜峰干擾,而且響應(yīng)值較低?？紤]到喹啉銅可溶于強酸,而酸性較強的鹽酸會對色譜柱和儀器造成損傷,試驗選擇在乙腈中加入0.1%三氟乙酸溶液,結(jié)果顯示,當(dāng)柑橘全果樣品中喹啉銅的加標量為0.5,2 mg·kg－1時,回收率分別為83.6%和89.6%,且喹啉銅色譜峰附近無雜峰干擾,因此試驗選擇以體積比為1∶9的0.1%三氟乙酸溶液和乙腈的混合溶液提取柑橘基質(zhì)樣品中的喹啉銅。

2.2 凈化填料的選擇

柑橘基質(zhì)復(fù)雜,若凈化不完全,不僅色譜分離效果不佳,還會污染儀器。C18、N-丙基乙二胺(PSA)和GCB為常見的凈化填料,其中C18為強疏水性吸附劑,對非極性、弱極性以及中等極性化合物具有廣泛保留特性,可以有效去除油脂等物質(zhì);PSA 為固相吸附劑,可以有效去除脂肪酸、有機酸和一些極性色素、糖;GCB對果蔬中的色素具有很強的吸附能力。試驗比較了以這3種填料凈化加標樣品溶液后喹啉銅的回收率,結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同填料凈化后喹啉銅的回收率Fig.1 Recovery of oxine-copper after purification with different packing materials

由圖1可知:以C18填料凈化時,喹啉銅的回收率為46.5%～76.7%;以PSA 填料凈化時,喹啉銅的回收率為56.3%～86.3%;以GCB 填料凈化時,喹啉銅回收率為83.5%～97.6%。只有以GCB 填料凈化時,喹啉銅的回收率達到了農(nóng)藥殘留分析的要求,因此試驗選擇以GCB凈化樣品。

進一步考察了GCB 用量對加標柑橘全果樣品中喹啉銅回收率的影響,如圖2所示。

圖2 不同用量GCB凈化后喹啉銅的回收率Fig.2 Recovery of oxine-copper after purification with different amounts of GCB

由圖2可知,當(dāng)GCB用量為5～50 mg時,柑橘全果樣品中喹啉銅回收率隨著GCB 用量的增加逐漸降低,推測GCB 與喹啉同為平面結(jié)構(gòu),兩者具有較好的空間匹配度,根據(jù)選擇性分子間作用力理論,喹啉銅可與GCB 相互作用而被吸附,GCB 用量越多,被吸附的喹啉銅就越多。因此,試驗選擇用5 mg GCB填料凈化樣品。

2.3 色譜行為

0.5mg·L－1喹啉銅標準溶液,柑橘全果、橘肉、橘皮陰性樣品及加標樣品(加標量0.5 mg·kg－1)的色譜圖見圖3。

圖3 喹啉銅標準溶液以及陰性、加標柑橘樣品的全果、橘肉、橘皮的色譜圖Fig.3 Chromatograms of oxine-copper standard solution and negative and spiked citrus samples of whole fruit,flesh and peel

由圖3 可知,喹啉銅的保留時間在3.5～4.5 min內(nèi),3種不同部位的柑橘基質(zhì)均不干擾喹啉銅的測定。

2.4 標準曲線、檢出限和測定下限

按照儀器工作條件分析標準溶液系列,以喹啉銅的質(zhì)量濃度為橫坐標,其對應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標進行線性擬合。結(jié)果顯示:喹啉銅標準曲線的線性范圍為0.1～5.0 mg·L－1,線性回歸方程為y＝1.254×105x＋1.466×103,相關(guān)系數(shù)為0.999 7。

以陰性樣品加標的方法確定檢出限和測定下限,以不小于3倍、10倍信噪比對應(yīng)的質(zhì)量濃度作檢出限和測定下限,所得結(jié)果分別為0.1,0.5 mg·kg－1。

2.5 精密度和回收試驗

按照試驗方法對陰性柑橘全果、橘肉、橘皮樣品進行3個濃度水平的加標回收試驗,每個濃度水平平行測定5次,計算回收率和測定值的相對標準偏差(RSD),結(jié)果見表1。

表1 精密度和回收試驗結(jié)果(n=5)Tab.1 Results of tests for precision and recovery(n=5)

由表1可知,柑橘全果、橘肉、橘皮中喹啉銅的回收率為83.6%～95.6%,測定值的RSD 為2.3%～6.7%。

2.6 樣品分析

按照試驗方法分析實際樣品,均未檢出喹啉銅的殘留。于當(dāng)?shù)厥袌霾少?0%(質(zhì)量分數(shù))喹啉銅懸浮劑,按照推薦劑量(稀釋800倍)噴施柑橘樹,施藥2 h后,按照1.3節(jié)試驗方法分析,在柑橘全果和橘皮樣品中檢出的喹啉銅殘留量分別為為0.91,1.41 mg·kg－1,橘肉樣品中未檢出喹啉銅殘留,滿足柑橘樣品中喹啉銅殘留分析的要求。

本工作采用0.1%三氟乙酸溶液和乙腈的混合溶液作提取劑,采用GCB 凈化樣品基質(zhì),采用HPLC測定柑橘全果、橘肉和橘皮中喹啉銅的殘留量,該方法干擾少、流動相溫和對色譜柱損傷小、分析時間短,且精密度和回收率均滿足殘留分析要求,適用于測定柑橘全果、橘肉和橘皮中的喹啉銅殘留量,也可為不同農(nóng)作物中喹啉銅農(nóng)藥殘留的分析提供依據(jù)和參考。