王欽，劉維新，李冬，張慧玲，袁琳琳，海雙雙，彭娜

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，沈陽 110001）

炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）是一類慢性、易復(fù)發(fā)的腸道炎性疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩?。?］。近年來自噬在IBD中的作用越來越受到關(guān)注，在人類基因組中發(fā)現(xiàn)了大量與IBD相關(guān)的基因變異，揭示了自噬在腸道穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用的關(guān)鍵途徑。IBD患者體內(nèi)常出現(xiàn)細(xì)胞自噬功能低下，但具體作用機(jī)制尚未闡明。核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號(hào)通路對(duì)炎性細(xì)胞因子的調(diào)控，在IBD的發(fā)生機(jī)制中具有重要地位［2］。研究［3］顯示，BALB/c小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型中自噬的抑制通路哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白被激活，并通過NF-κB途徑抑制腸上皮細(xì)胞的自噬，以調(diào)節(jié)腸道炎癥。本課題組前期研究［4］發(fā)現(xiàn)，高脂飲食會(huì)加重潰瘍性結(jié)腸炎，增加腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）活性。TNF-α可以進(jìn)一步活化NFκB，加重炎癥和組織損傷，影響結(jié)腸黏膜愈合［5］。高脂飲食下誘導(dǎo)的脂質(zhì)刺激會(huì)降低自噬小體和溶酶體之間的融合效率，從而抑制自噬［6］。但是高脂飲食是否改變自噬在IBD中的表達(dá)，國(guó)內(nèi)外尚缺乏相關(guān)研究證據(jù)。本研究通過建立高脂飲食下葡聚糖硫酸鈉（dextran sodium sulfate，DSS）誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型，進(jìn)一步闡明高脂飲食調(diào)控下自噬在IBD中的作用及其機(jī)制，為臨床IBD的治療和預(yù)防提供新方向。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

選用8周齡BALB/c雄性小鼠48只，體質(zhì)量19～23 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。實(shí)驗(yàn)前，小鼠在溫度（24±2）℃、濕度40%～50%、晝夜循環(huán)12 h的無特定病原體環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 材料

高脂飼料：基礎(chǔ)飼料+15%豬油+15%蔗糖，購(gòu)自江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司。DSS，分子量36×103～50×103，購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司。小鼠白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6、IL-10、TNF-α ELISA試劑盒，購(gòu)自凡科維公司。NF-κB和LC3引物序列，購(gòu)自蘇州泓迅生物科技股份有限公司。RNA提取試劑盒和PCR試劑盒，購(gòu)自上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司。小鼠墊料和正常維持飼料均為實(shí)驗(yàn)室自備。

1.3 方法

1.3.1 模型建立和分組：適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（Control組）、高脂飲食組（HFD組）、DSS組、DSS+高脂飲食組（DSS+HFD組），每組12只，采用剪趾法編號(hào)。配置3% DSS飲用水，每日更換。予以Control組小鼠滅菌水和正常飲食，自由進(jìn)食。予以HFD組小鼠滅菌水和高脂飲食，自由進(jìn)食。予以DSS組、DSS+HFD組小鼠3% DSS飲用水3 d+滅菌水4 d為1個(gè)循環(huán)周期，以此重復(fù)9個(gè)周期。分別予以DSS組、DSS+HFD組小鼠正常飲食和高脂飲食，自由進(jìn)食。

1.3.2 體質(zhì)量差值的比較：每日記錄小鼠的體質(zhì)量，計(jì)算各組小鼠體質(zhì)量與該周期初始體質(zhì)量的差值，比較體質(zhì)量差值的變化情況。

1.3.3 疾病活動(dòng)指數(shù)（disease activity index，DAI）的評(píng)估：按照體質(zhì)量下降（體質(zhì)量下降百分比為當(dāng)日體質(zhì)量下降值與前一日體質(zhì)量之比，＜1%，0分；1%～＜5%，1分；5%～＜10%，2分；10%～＜20%，3分；≥20%，4分）、大便性狀（成形大便，0分；松散大便且不粘附肛門，2分；稀便且粘附肛門，4分）和便血（隱血陰性，0分；隱血陽性，2分；肉眼血便，4分）的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，每天觀察記錄3項(xiàng)指標(biāo)計(jì)算總評(píng)分，得到DAI。

1.3.4 標(biāo)本采集：于第1、5循環(huán)周期末各組處死4只小鼠，第9循環(huán)周期末處死各組剩余小鼠。處死前1 h給予小鼠自由飲用水，摘取眼球取血，放入1 mL EP管中，4 ℃冰箱內(nèi)靜置2 h，在4 ℃、3 000 r/min下離心15 min，提取血清，留存于-80 ℃冰箱。取小鼠結(jié)腸作縱行切開，用生理鹽水沖凈后，截取1 cm左右的結(jié)腸組織，用10%甲醛溶液進(jìn)行組織固定，石蠟包埋結(jié)腸組織，HE染色。在液氮中快速冷凍1 cm的相鄰部分，置于凍存管中，留存于-80 ℃冰箱。

1.3.5 結(jié)腸組織病理學(xué)損傷情況觀察：在光鏡下觀察結(jié)腸組織，按照組織病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算總評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：上皮組織無損傷破壞、無炎癥浸潤(rùn)，0分；少量杯狀細(xì)胞破壞、炎癥浸潤(rùn)至隱窩基底周圍，1分；廣泛杯狀細(xì)胞破壞、炎癥浸潤(rùn)至黏膜肌層，2分；廣泛杯狀細(xì)胞破壞及少量腺體破壞、黏膜肌層廣泛炎癥浸潤(rùn)并水腫增厚，3分；大量腺體消失、炎癥浸潤(rùn)至黏膜下層，4分。

1.3.6 血清中IL-6、IL-10和TNF-α的表達(dá)情況檢測(cè)：取出-80 ℃冰箱中留存的小鼠血清，按照ELISA試劑盒說明書操作。

1.3.7 結(jié)腸組織中NF-κB和LC3mRNA的表達(dá)水平檢測(cè)：按照PCR試劑盒說明書，在QuantStudio 3 Real-Time PCR System上用SYBR-GREEN進(jìn)行特定引物配對(duì)擴(kuò)增，檢測(cè)mRNA的表達(dá)。反應(yīng)體系包括2 μL cDNA，10 μL SYBR Premix，上下游引物各0.4 μL，7.2 μL去離子水。引物序列：NF-κB，正向5’-GAAGCACGAATGAC AGAGGC-3’，反向5’-GCTTGGCGGATTAGCTCTTT T-3’；LC3，正向5’-AACATGAGCGAGTTGGTCAA G-3’，反向5’-GCTCGTAGATGTCCGCGAT-3’。將目標(biāo)基因和管家基因的Ct值代入公式2-ΔΔCt進(jìn)行定量分析，獲得目標(biāo)基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 體質(zhì)量差值變化

第5循環(huán)周期末開始，除Control組外，其他3組小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)幅度均降低。到第9循環(huán)周期末，DSS+HFD組小鼠體質(zhì)量甚至出現(xiàn)了負(fù)增長(zhǎng)。第5、9循環(huán)周期末，DSS組體質(zhì)量差值小于Control組（P＜0.05），DSS+HFD組體質(zhì)量差值小于Control組和DSS組（均P＜ 0.05）。見表1。

表1 第1、5、9循環(huán)周期末4組小鼠體質(zhì)量差值、DAI、組織病理學(xué)評(píng)分的比較Tab.1 Comparison of body mass difference，DAI，and histopathological score at the end of the 1st，5th，and 9th cycle in the four groups

2.2 小鼠一般情況和DAI的比較

第1循環(huán)周期末，DSS誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎癥狀不明顯。第2循環(huán)周期開始后，DSS組和DSS+HFD組個(gè)別小鼠出現(xiàn)大便隱血陽性，其中DSS+HFD組個(gè)別小鼠還出現(xiàn)了松散大便。第5循環(huán)周期開始后，DSS組和DSS+HFD組小鼠大便隱血均為陽性，其中DSS+HFD組大部分小鼠還伴隨肉眼血便和松散大便，更換為滅菌水后，DSS組和DSS+HFD組小鼠大便隱血陽性轉(zhuǎn)陰、肉眼血便消失。第9循環(huán)周期開始后，DSS組和DSS+HFD組小鼠都出現(xiàn)了大便隱血陽性或肉眼血便，其中DSS+HFD組小鼠出現(xiàn)了腹瀉；更換為滅菌水后，DSS組大部分小鼠大便隱血陽性轉(zhuǎn)陰、肉眼血便消失，但DSS+HFD組小鼠腹瀉和大便隱血陽性仍持續(xù)。第9循環(huán)周期末，HFD組個(gè)別小鼠出現(xiàn)了松散大便。Control組小鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中一般情況好、大便正常。

第1、5、9循環(huán)周期末，DSS組和DSS+HFD組DAI均大于Control組（P＜ 0.05）。第5、9循環(huán)周期末，DSS+HFD組DAI大于DSS組（P＜ 0.05）。第9循環(huán)周期末，HFD組DAI大于Control組（P＜ 0.05）。見表1。

2.3 結(jié)腸組織病理學(xué)情況

第1循環(huán)周期末，Control組和HFD組結(jié)腸組織各層結(jié)構(gòu)清晰可見、無炎癥浸潤(rùn)和上皮組織損傷；DSS組結(jié)腸組織可見杯狀細(xì)胞破壞，炎癥浸潤(rùn)至隱窩基底周圍，個(gè)別小鼠炎癥浸潤(rùn)至黏膜肌層；DSS+HFD組結(jié)腸組織炎癥廣泛浸潤(rùn)至黏膜肌層并水腫增厚，伴廣泛杯狀細(xì)胞破壞。第5、9循環(huán)周期末，Control組無明顯變化；DSS組出現(xiàn)少量腺體破壞，黏膜肌層均可見廣泛炎癥浸潤(rùn)并水腫增厚，個(gè)別小鼠出現(xiàn)大量腺體破壞和消失；DSS+HFD組小鼠均出現(xiàn)大量腺體萎縮或消失，炎癥浸潤(rùn)至黏膜下層。第9循環(huán)周期末，HFD組個(gè)別小鼠出現(xiàn)少量杯狀細(xì)胞破壞，有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)在隱窩基底周圍。見圖1。第1、5、9循環(huán)周期末，DSS組和DSS+HFD組病理組織學(xué)評(píng)分均大于Control組（P＜ 0.05），且DSS+HFD組大于DSS組（P＜ 0.05）；第9循環(huán)周期末，HFD組病理組織學(xué)評(píng)分大于Control組（P＜ 0.05）。見表1。

圖1 第1、5、9循環(huán)周期末4組小鼠結(jié)腸組織病理圖片 ×200Fig.1 Pathological pictures of colonic tissue at the end of the 1st，5th，and 9th cycle in the four groups ×200

2.4 血清中IL-6、TNF-α和IL-10表達(dá)情況

2.4.1 IL-6表達(dá)水平：第1、5、9循環(huán)周期末，DSS組和DSS+HFD組血清IL-6水平均高于Control組（P＜0.05）。第9循環(huán)周期末，DSS+HFD組血清IL-6水平高于DSS組（P＜ 0.05）。見表2。

2.4.2 TNF-α表達(dá)水平：第1、5、9循環(huán)周期末，DSS+HFD組血清TNF-α水平高于Control組和DSS組（均P＜ 0.05）。第5、9循環(huán)周期末，HFD組和DSS組血清TNF-α水平均高于Control組（P＜ 0.05）。見表2。

2.4.3 IL-10表達(dá)水平：第5、9循環(huán)周期末，DSS+HFD組血清IL-10水平低于Control組（P＜ 0.05），雖低于DSS組但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。見表2。

表2 第1、5、9循環(huán)周期末4組小鼠血清中IL-6、TNF-α和IL-10的表達(dá)水平Tab.2 Serum levels of IL-6，TNF-α，and IL-10 at the end of the 1st，5th，and 9th cycle in the four groups

2.5 結(jié)腸組織中NF-κB和LC3 mRNA表達(dá)情況

2.5.1NF-κBmRNA表達(dá)水平：DSS組和DSS+HFD組結(jié)腸組織NF-κBmRNA水平均高于Control組（P＜0.05），且DSS+HFD組高于DSS組（P＜ 0.05）。見表3。

表3 4組小鼠結(jié)腸組織中NF-κB和LC3 mRNA表達(dá)情況Tab.3 Expression of NF-κB and LC3 mRNA in the colonic tissue in the four groups

2.5.2LC3mRNA表達(dá)水平：DSS組和DSS+HFD組結(jié)腸組織LC3mRNA水平均低于Control組（P＜ 0.05），且DSS+HFD組低于DSS組（P＜ 0.05）。見表3。

3 討論

近年來，我國(guó)IBD發(fā)病率上升速度顯著增快［7］。肥胖被認(rèn)為是導(dǎo)致IBD發(fā)生的危險(xiǎn)因素之一［8］。高脂飲食是引起肥胖的重要原因，研究［9］發(fā)現(xiàn)，高脂飼料會(huì)引起NF-κB活化、輔助性T細(xì)胞17分化、腸道微生物區(qū)系組成紊亂，導(dǎo)致結(jié)腸炎。脂類在消化道分解的產(chǎn)物會(huì)損害腸道內(nèi)微環(huán)境，誘發(fā)腸黏膜炎癥，使腸黏膜屏障受損［10］。與高碳水化合物飲食相比，高脂飲食與腸道微生物群的顯著差異有關(guān)［11］。第5、9循環(huán)周期末，DSS組體質(zhì)量差值小于Control組（P＜ 0.05），DSS+HFD組體質(zhì)量差值小于Control組和DSS組（均P＜ 0.05），表明潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的正常生長(zhǎng)進(jìn)程遭到破壞，而高脂飲食進(jìn)一步加重了嚴(yán)重程度。第1、5、9循環(huán)周期末，DSS組和DSS+HFD組DAI均高于Control組（P＜ 0.05）；第5、9循環(huán)周期末，DSS+HFD組DAI大 于DSS組（P＜ 0.05）；第9循環(huán)周期末，HFD組DAI大于Control組（P＜ 0.05）。結(jié)腸組織病理切片顯示，DSS+HFD組的炎癥浸潤(rùn)范圍和程度、杯狀細(xì)胞和腺體破壞的數(shù)量均較DSS組嚴(yán)重；第9循環(huán)周期末，HFD組個(gè)別小鼠出現(xiàn)少量杯狀細(xì)胞破壞和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。第1、5、9循環(huán)周期末，DSS組和DSS+HFD組病理組織學(xué)評(píng)分均大于Control組（P＜0.05），且DSS+HFD組大于DSS組（P＜ 0.05）；第9循環(huán)周期末，HFD組病理組織學(xué)評(píng)分大于Control組（P＜0.05）。小鼠體質(zhì)量差值、DAI、結(jié)腸組織病理切片和病理學(xué)組織評(píng)分結(jié)果均表明，高脂飲食會(huì)誘發(fā)結(jié)腸炎癥以及加重DSS誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎。

本研究通過檢測(cè)血清炎性細(xì)胞因子水平進(jìn)一步證實(shí)潰瘍性結(jié)腸炎的炎癥程度改變，第1、5、9循環(huán)周期末，DSS+HFD組TNF-α水平高于DSS組和Control組（均P＜ 0.05），第5、9循環(huán)周期末HFD組和DSS組TNF-α水平均高于Control組（P＜ 0.05）；第1、5、9循環(huán)周期末，DSS組和DSS+HFD組IL-6水平均高于Control組（P＜ 0.05），第9循環(huán)周期末DSS+HFD組IL-6水平高于DSS組（P＜ 0.05）。結(jié)果表明，高脂飲食下腸道促炎性細(xì)胞因子IL-6、TNF-α的分泌增加，進(jìn)一步加重了潰瘍性結(jié)腸炎。IL-10的保護(hù)作用已在DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型中被證實(shí)，IL-10的丟失促進(jìn)了IBD的發(fā)展［12］。本研究中，潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型中IL-10的表達(dá)經(jīng)歷了炎癥期的丟失和恢復(fù)期的活化這一不斷累積的過程，所以隨著循環(huán)周期的增加，雖然DSS組和DSS+HFD組小鼠IL-10的表達(dá)水平較循環(huán)初期增長(zhǎng)，但與Control組相比仍降低；第5、9循環(huán)周期末，DSS+HFD組IL-10水平低于Control組（P＜ 0.05），雖低于DSS組但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

本研究檢測(cè)了小鼠結(jié)腸組織中NF-κB和LC3mRNA的相對(duì)表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DSS組和DSS+HFD組NF-κBmRNA水平均高于Control組（P＜ 0.05），且DSS+HFD組高于DSS組（P＜ 0.05）；DSS組 和DSS+HFD組LC3mRNA水平均低于Control組（P＜ 0.05），且DSS+HFD組低于DSS組（P＜ 0.05）。炎癥較重的DSS+HFD組小鼠NF-κBmRNA表達(dá)水平比炎癥較輕的DSS組高，提示高脂飲食下NF-κB進(jìn)一步活化，加重了潰瘍性結(jié)腸炎。炎癥較輕的DSS組小鼠自噬標(biāo)志物L(fēng)C3mRNA表達(dá)水平比炎癥較重的DSS+HFD組高，提示自噬在潰瘍性結(jié)腸炎中起抗炎作用，考慮高脂飲食下NF-κB進(jìn)一步活化，抑制自噬的表達(dá)，加重了潰瘍性結(jié)腸炎。

綜上所述，DSS組和DSS+HFD組小鼠與Control組小鼠相比，都有腸道炎癥加重、NF-κB活化、自噬表達(dá)受抑制的表現(xiàn)，其中DSS+HFD組小鼠的上述表現(xiàn)更為顯著，考慮和高脂飲食下NF-κB進(jìn)一步活化使自噬的表達(dá)受抑制相關(guān)，同時(shí)進(jìn)一步證實(shí)了高脂飲食是介導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎改變的重要因素，提示抑制NF-κB信號(hào)通路的治療藥物和自噬在潰瘍性結(jié)腸炎中的抗炎作用有希望為治療和預(yù)防IBD提供新機(jī)會(huì)。