王少磊，張倩，宋續(xù)軍，李雪，王麗喆，劉杰

（1.青島大學(xué)附屬醫(yī)院口腔修復(fù)科，山東 青島 266003；2.青島大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔修復(fù)學(xué)教研室，山東 青島 266003）

種植義齒修復(fù)已成為治療牙齒缺失的主要方式。隨著種植義齒的廣泛應(yīng)用，患種植體周圍炎的患者逐年增多。種植體周圍炎是由牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.g）為代表的菌斑微生物引發(fā)的炎癥性疾病，牙齦組織充血水腫、牙槽嵴破壞吸收為其典型特點［1］。研究［2］表明，該病5～10年發(fā)病率約為10%～20%，若得不到及時有效的治療將會引發(fā)種植體松動脫落，導(dǎo)致種植失敗。因此，有必要對其發(fā)病機制進行深入研究，以期尋找治療的新方法。

CXCR2是重要的趨化因子受體，屬于G蛋白耦聯(lián)受體家族，在多種炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用。研究［3］表明，CXCR2能通過與CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7等白細胞介素-8（interleukin-8，IL-8）家族趨化因子結(jié)合，將以中性粒細胞為代表的白細胞、淋巴細胞趨化至炎癥局部，發(fā)揮免疫炎癥調(diào)控作用。研究［4-7］發(fā)現(xiàn)，CXCR2結(jié)合其配體IL-8、CXCL1、CXCL2能夠誘導(dǎo)破骨細胞生成，引發(fā)骨質(zhì)吸收。種植體周圍炎作為一種典型的炎癥性骨破壞性疾病，其組織病理特點為炎癥細胞浸潤、破骨細胞生成及骨質(zhì)吸收。鑒于CXCR2在炎癥及骨免疫中的重要作用，推測CXCR2在種植體周圍炎中可能扮演重要角色。因此，本研究利用SB225002抑制CXCR2，初步探討CXCR2在小鼠種植體周圍炎發(fā)病機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：36只SPF級4周齡雄性C57BL/6J小鼠購自濟南朋悅動物中心，許可證號SCXK（魯）20190003，體質(zhì)量15～18 g。經(jīng)青島大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準，飼養(yǎng)于青島大學(xué)附屬醫(yī)院中心實驗室動物實驗中心的無菌單元內(nèi)，整個實驗過程中可隨意進食無菌水和軟質(zhì)飼料。

1.1.2P.g（ATCC 33277）：培養(yǎng)于37 ℃厭氧環(huán)境中（5%H2、5%CO2、90%N2）。采用分光光度計測定菌落集成單位（colony forming unit，CFU），將對數(shù)生長期的細菌稀釋至1×109CFU后進行熱滅活［8］，將5-0絲線放入菌液中浸泡30 min，用于后續(xù)實驗。

1.2 方法

1.2.1 建立小鼠種植體周圍炎模型：小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，腹腔注射氯胺酮（100 mg/kg）和賽拉嗪（5 mg/kg）全身麻醉，拔除右側(cè)上頜第一磨牙，在腭根窩洞內(nèi)即刻植入種植體（定制于威高集團，尺寸為長1.7 mm，主直徑0.7 mm，冠方六邊形邊長0.9 mm，尖端直徑0.4 mm）［9］。愈合4周達骨結(jié)合后，將小鼠隨機分為對照組、模型組及治療組，每組12只。將浸有熱滅活P.g的5-0絲線結(jié)扎在模型組和治療組種植體頸部，對照組不做處理。

1.2.2 注射CXCR2抑制劑SB225002：絲線結(jié)扎后，治療組每天腹腔注射CXCR2抑制劑SB225002（美國Selleck公司）2 mg/kg，對照組及模型組腹腔注射等量生理鹽水。連續(xù)注射14 d后，觀察小鼠生存狀態(tài)及種植體狀況。

1.2.3 獲取標本：每組隨機選取6只小鼠處死，切取腭側(cè)牙齦進行RT-PCR分析，剩余上頜骨標本用于Micro-CT檢測。其余6只小鼠處死后切取上頜骨標本，旋出種植體，常規(guī)制作石蠟切片，用于組織化學(xué)分析。

1.3 檢測與分析

1.3.1 形態(tài)學(xué)觀察：用顯微組織鑷對種植體進行叩診和松動度檢查。肉眼觀察牙齦的顏色、質(zhì)地及形態(tài)，評估種植體周圍組織的炎癥變化。

1.3.2 Micro-CT分 析：使用μCT100（瑞士SCANCO Medical AG公司）掃描上頜骨標本。參數(shù)為工作電壓70 kVp，電流200 μA，分辨率10 μm，曝光時長500 ms，每視圖5幀。獲取數(shù)據(jù)后導(dǎo)入 Mimics Research 20.0 軟件進行三維重建和分析。為量化種植體周圍骨吸收情況，將種植體周圍直徑1.0 mm、高1.7 mm、軸線與種植體長軸重合的圓柱體體積定義為感興趣體積（volume of interest，VOI），計算VOI內(nèi)的骨體積分數(shù)（bone volume/total volume，BV/TV）。

圖5 組織學(xué)分析結(jié)果Fig.5 Histological analysis results

1.3.3 HE、TRAP及免疫熒光染色（immunofluorescence staining，IF）：HE及TRAP染色方法參照文獻［9］，染色完成后使用配有攝像機的顯微鏡（日本Olmpus公司）觀察采集圖像，通過Cellsens軟件進行分析。在400倍視野下觀察HE染色組織切片，于種植體腭側(cè)纖維結(jié)締組織中隨機選取4個50 μm×50 μm的方形區(qū)域，計算總炎癥細胞密度。對牙槽嵴頂?shù)钠乒羌毎嫈?shù)，將TRAP染色組織切片中一邊與種植體長軸重合一邊位于種植體骨內(nèi)第一螺紋的正方形區(qū)域（0.5 mm×0.5 mm）定義為感興趣區(qū)域（region of interest，ROI），將該區(qū)域內(nèi)細胞核呈深藍色、細胞質(zhì)呈粉紅色的TRAP陽性細胞記為破骨細胞。IF中，采用Ly6G（中性粒細胞表面標志物）標記中性粒細胞［10］。石蠟切片脫蠟后，使用胃蛋白酶修復(fù)液進行抗原修復(fù)，3%BSA封閉，加入兔抗鼠Ly6G抗體（1 ∶400稀釋，武漢Servicebio公司），4 ℃濕盒內(nèi)孵育12 h，加入熒光二抗，避光室溫孵育50 min，加入DAPI染液復(fù)染細胞，淬滅組織自發(fā)熒光后封片，于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。使用ImageJ軟件計算每張圖片Ly6G平均熒光強度，用于評估中性粒細胞浸潤情況。

1.3.4 RT-PCR分析：將牙齦組織在預(yù)冷的研缽中研磨成粉末狀，用TRIzol抽提總RNA，用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒（日本TaKaRa公司）逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用RT-PCR法檢測Cxcl1及細胞核因子-κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，Rankl）mRNA表達情況。引物序列如下，Cxcl1，F(xiàn)5’-GGGCGCCTATCGCCAATG AG-3’，R5’-GGGAGCTTCAGGGTCAAGGC-3’；Rankl，F(xiàn)5’-ACGTGAGCTATGGAAGGGGGT-3’，R5’-GCAGGTCCCAGCGCAATGTA-3’；Gapdh，F(xiàn)5’-CGTGTTCCTACCCCCAATGT-3’，R5’-TGTCAT CATACTTGGCAGGTTTCT-3’。按照2-△△Ct法計算目的基因相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 24.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料用表示。采用獨立樣本t檢驗對2組間數(shù)據(jù)進行比較，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)扎浸有熱滅活P.g的絲線可誘發(fā)種植體周圍炎

種植體植入4周后，叩診檢查所有種植體呈清脆金屬音，用顯微組織鑷近中、遠中、頰側(cè)、舌側(cè)方向夾持時均無松動，周圍牙齦粉紅色，質(zhì)地堅韌，無腫脹充血，表明骨結(jié)合成功［11］。炎癥誘導(dǎo)2周，未出現(xiàn)小鼠死亡或種植體脫落。模型組及治療組種植體近中、遠中、頰側(cè)、舌側(cè)方向上均出現(xiàn)松動，牙齦深紅色，質(zhì)地松脆，腫脹充血。治療組牙齦腫脹程度較模型組輕，見圖1。

圖1 炎癥誘導(dǎo)2周時口內(nèi)情況Fig.1 Intraoral conditions after 2 weeks of inflammation induction

2.2 抑制CXCR2可減輕小鼠種植體周圍骨吸收

模型組及治療組小鼠種植體周圍出現(xiàn)凹形骨吸收，骨密度減低，骨高度下降，見圖2。與對照組相比，模型組的BV/TV顯著降低（P＜ 0.05），而治療組的BV/TV較模型組顯著升高（P＜ 0.05），見圖3。

圖2 Micro-CT二維及三維掃描結(jié)果Fig.2 Micro-CT 2D and 3D scan results

圖3 骨體積分數(shù)比較Fig.3 The comparison of bone volume fraction

2.3 抑制CXCR2后種植體周圍組織中的中性粒細胞和破骨細胞減少

HE染色及IF染色結(jié)果顯示，相較于對照組，模型組牙齦組織中的總炎癥細胞及中性粒細胞顯著增多，而治療組牙齦組織中的總炎癥細胞及中性粒細胞較模型組顯著減少（P＜ 0.05），見圖4、5A、5B。TRAP染色結(jié)果顯示，模型組ROI內(nèi)的破骨細胞數(shù)量顯著高于對照組，而抑制CXCR2的治療組ROI內(nèi)的破骨細胞數(shù)量較模型組顯著下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜ 0.05），見圖4、5C。

圖4 組織學(xué)染色結(jié)果Fig.4 Histological staining results

2.4 抑制CXCR2能降低Cxcl1和Rankl mRNA表達水平

RT-PCR結(jié)果顯示，模型組小鼠牙齦組織中Cxcl1、RanklmRNA的相對表達水平較對照組明顯升高；治療組小鼠牙齦中Cxcl1、RanklmRNA的相對表達水平較模型組顯著下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05），見圖6。

圖6 Cxcl1和Rankl mRNA表達RT-PCR檢測結(jié)果Fig.6 The mRNA expression of Cxcl1 and Rankl detected by RT-PCR

3 討論

小鼠種植體周圍炎模型是研究種植體周圍炎病理機制的重要工具。本研究采用的即刻種植方式能有效減少對小鼠的創(chuàng)傷并縮短實驗周期，是一種科學(xué)、高效的小鼠種植體植入方法。種植體周圍炎被定義為發(fā)生在已完成骨結(jié)合的種植體周圍組織的炎癥。與人類不同，小鼠種植體植入后愈合4周便能達到理想的骨結(jié)合［11-12］。因此，本研究在愈合4周后對小鼠骨結(jié)合情況進行了確認，并引入了炎癥誘導(dǎo)因素。本研究在前期研究［9］建模方法的基礎(chǔ)上引入熱滅活P.g，比單純結(jié)扎絲線能更好地模擬細菌因素在種植體周圍炎發(fā)病機制中的作用。

種植體周圍炎與牙周炎相似，是一種由細菌引發(fā)、宿主免疫因素參與的感染性疾病［1］。研究［13-15］認為，趨化因子IL-8及其受體CXCR2與種植體周圍炎和牙周炎的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究中，種植體周圍炎小鼠牙齦中的Cxcl1（人IL-8小鼠同源物）mRNA表達升高，使用CXCR2抑制劑后表達下降，進一步證實了上述觀點。

IL-8與CXCR2結(jié)合后的主要效應(yīng)是募集活化中性粒細胞。中性粒細胞釋放的基質(zhì)金屬蛋白酶、活性氧、胞外誘捕網(wǎng)在殺傷病原微生物的同時也會降解周圍組織，加重組織破壞。通過趨化因子受體調(diào)控中性粒細胞是抗炎治療的重要方式［3］。ALAM等［16］在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎及特異性皮炎的研究中發(fā)現(xiàn)，用抗體阻斷CXCR2能夠抑制小鼠中性粒細胞募集，并減輕炎癥。STEELE等［17］認為基因敲除CXCR2或者使用藥物抑制CXCR2均能有效治療小鼠胰腺炎。ZHU等［18］發(fā)現(xiàn)抑制CXCR2后中性粒細胞釋放的髓過氧化物酶、腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1β等促炎癥介質(zhì)減少，而且CXCR2抑制劑SB225002能夠緩解小鼠潰瘍性結(jié)腸炎。本研究利用SB225002抑制種植體周圍炎小鼠的CXCR2，發(fā)現(xiàn)牙齦組織中總炎癥細胞及中性粒細胞顯著減少，牙齦炎癥減輕，與上述研究結(jié)果一致，證明了抑制CXCR2對種植體周圍牙齦炎癥的治療具有積極作用。

除牙齦軟組織的炎癥外，種植體周圍炎還伴隨活躍的牙槽嵴吸收過程。RANKL在該過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，通過與前破骨細胞上的細胞核因子-κB受體活化因子（receptor activator of nuclear factor-κB，RANK）結(jié)合，誘導(dǎo)破骨細胞分化成熟，進而促進骨質(zhì)吸收［19］。本研究阻斷CXCR2后，RanklmRNA表達量及破骨細胞數(shù)量顯著下降，可能與抑制CXCR2受體導(dǎo)致的中性粒細胞募集減少有關(guān)。中性粒細胞是RANKL的重要來源細胞，不僅可通過表達膜結(jié)合型RANKL直接誘導(dǎo)破骨細胞活化，還可通過分泌彈性蛋白酶對RANKL的競爭性配體骨保護素進行降解，間接促進破骨細胞的生成［20-21］。本研究中，抑制CXCR2受體后引發(fā)的RanklmRNA表達下降、破骨細胞減少還可能與IL-8的生物效能被阻斷有關(guān)。IL-8是一種多效細胞因子，通過與CXCR2結(jié)合，激活下游信號，不僅可以促進RANKL的表達，還可直接誘導(dǎo)破骨細胞生成。KOPESKY等［22］的體外研究證明，即使RANKL持續(xù)存在，向前破骨細胞中添加IL-8抗體或者CXCR2拮抗劑仍能有效抑制破骨細胞的分化。因此，本研究中阻斷CXCR2后出現(xiàn)的RanklmRNA表達下降、破骨細胞減少可能是中性粒細胞募集減少和IL-8功能受阻的綜合表現(xiàn)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，抑制CXCR2能夠減少小鼠種植體周圍炎的中性粒細胞募集和破骨細胞生成，進而緩解小鼠種植體周圍炎，但其具體的病理機制尚需進一步研究。由于研究條件有限，本研究未對在小鼠種植體周圍炎中抑制CXCR2產(chǎn)生的作用進行時序觀察，有待今后進一步探究。