李明虹，楊舒筠，李丹，李星道，劉希沖，高文婷，姬曉彤，白劍英

（1.山西醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院環(huán)境衛(wèi)生學教研室，太原 030001；2.太原市疾病預防控制中心有害生物控制科，太原 030001）

亞硫酸鈉（Na2SO3）在食品生產和加工行業(yè)中廣泛用作添加劑、防腐劑、還原劑、骨質疏松劑或色素去除劑［1］，通常存在于堅果、果脯、干菜、銀耳、粉絲、馬鈴薯或甘薯淀粉、竹筍、罐頭、高濃度葡萄酒和果酒等食品中［2］。研究［3］表明Na2SO3對神經(jīng)系統(tǒng)有毒性，Na2SO3氧化酶缺乏時表現(xiàn)一定的神經(jīng)系統(tǒng)損傷癥狀（智力低下、共濟失調、疲勞等）。當體內Na2SO3高水平（約2 mmol/L）蓄積時，會導致嬰兒或青少年早期死亡。Na2SO3也可引起特定敏感人群的致命哮喘［4］。研究［5］顯示Na2SO3與腎臟損害有關，長期透析治療的慢性腎臟病患者尿中Na2SO3濃度平均為（3.80±3.32 ）μmol/L，高于健康人群［（1.55±0.54）μmol/L］。

前期研究發(fā)現(xiàn)Na2SO3暴露可導致小鼠肝臟壞死性改變，這與Na2SO3暴露增加血清轉氨酶活性并可能導致肝損傷的臨床研究［6］結果一致。前期研究［7］還發(fā)現(xiàn)Na2SO3可增加肝細胞受體相互作用蛋白激酶1（receptor interacting protein kinase 1，RIP1）的表達，這說明Na2SO3可能與程序性細胞壞死或凋亡有關。自噬是一種高度保守的機制，將受損的細胞、退化或老化的蛋白質和細胞器帶到溶酶體消化，以維持細胞內穩(wěn)態(tài)。在正常生理過程中，自噬可以抵抗病毒感染，限制過度炎癥反應，起到保護機體穩(wěn)態(tài)的作用［7］。研究［8］發(fā)現(xiàn)自噬抑制可促進癌細胞凋亡、壞死，自噬缺陷也會導致肝臟中的蛋白質積累，導致肝腫大、肝細胞死和肝衰竭。

自噬相關蛋白LC3在自噬過程中發(fā)揮關鍵作用，自噬受體蛋白p62通過泛素化與LC3相互作用區(qū)域（LC3 interacting region，LIRs）結合，并促進底物與吞噬體的結合。因此，LC3和底物蛋白p62的結合在底物的選擇、靶向和降解中至關重要［9］。AMP活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）是一種關鍵的能量傳感器，可感知細胞能量狀態(tài)以維持能量穩(wěn)態(tài)，是自噬調節(jié)的關鍵蛋白［10］。本研究探討Na2SO3暴露對人正常肝細胞自噬的影響及其作用機制，旨在為制定食品添加劑中Na2SO3安全限值提供一定的參考價值，同時為嚴重Na2SO3中毒治療尋找可能的作用靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞株與主要試劑

人正常肝細胞株HL-7702購自中國科學院上海細胞生物研究所干細胞庫。主要試劑包括Na2SO3（美國Sigma-Aldrich公司）、胰蛋白酶（美國Sigma-Aldrich公司）、DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）、CCK-8試劑盒（日本Dojindo Molecular Technologies公司）、Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG（美國Invitrogen公司）、胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司）、蛋白顯影發(fā)光液ECL Plus試劑盒（美國Pierce Biotechnology公司）、ATP檢測試劑盒（S0026）（上海碧云天生物技術有限公司）。主要抗體包括兔抗LC3B（D11）單克隆抗體、兔抗SQSTM1/p62單克隆抗體、兔抗AMPKα、兔抗p-AMPKα、小鼠抗caspase-3單抗和兔抗cleaved caspase-3（Asp175）（美 國Cell Signaling Technology公司），兔抗β-actin單抗（Asp175）（美國Santa Cruz Biotechnology公司），辣根過氧化物酶標記的二抗（武漢三鷹生物公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)、分組及處理

用DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)HL-7702細胞。在培養(yǎng)基中添加谷氨酰胺（1 mmol/L）、青霉素（100 U/mL），鏈霉素（100 μg/mL）和10% 胎牛血清，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3 d傳代1次，取對數(shù)生長期細胞進行后續(xù)實驗。

待細胞融合度達80%左右時，用0.25%胰酶消化細胞，制成細胞懸液，調整細胞密度鋪板，將細胞分為7組：陰性對照組（含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基），Na2SO3暴露組（0.1、1、2.5、5mmol/L），陽性對照組（CCl420 mmol/L）和溶劑對照組（0.2% DMSO），每組設3個平行。按分組處理細胞后，將各組細胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中分別暴露2 h、48 h后，進行后續(xù)實驗研究。

1.3 CCK-8試劑盒測定細胞活力

HL-7702細胞長到80%，用0.25%胰酶消化細胞，制成細胞懸液，將細胞接種于96孔板中，每孔100 μL（1.5×105/孔）細胞懸液，將培養(yǎng)板置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱預培養(yǎng)24 h。按分組及Na2SO3暴露時間干預HL-7702。待暴露結束后向每孔加入10 μL CCK-8試劑，將培養(yǎng)板置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱4 h，用酶標儀測定各組細胞在450 nm處的吸光度（optical density，OD）值，計算各組細胞存活率，細胞存活率（%）=（暴露組OD值-空白組OD值）/（陰性對照組OD值-空白組OD值）×100?？瞻捉M為只含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。

1.4 免疫熒光法檢測LC3B蛋白表達

HL-7702細胞長到80%，用0.25%胰酶消化細胞，制成細胞懸液，將細胞接種于24孔板上，按實驗分組干預2 h、48 h后，吸棄上清，每孔用無菌PBS清洗3次，每次5 min；每孔加預冷4%甲醇室溫固定20 min。然后用PBS/0.1%Triton滲透細胞，10%山羊血清封閉，一抗LC3B抗體（1 ∶200）稀釋孵育過夜，PBS洗滌3次，每次3 min，Alexa 488標記的二抗（1 ∶500）稀釋孵 育2 h。PBS洗滌3次后，Hoechst33342復染10 min，抗熒光猝滅劑封片。免疫熒光顯微鏡觀察圖片。

1.5 Western blotting 檢測HL-7702細胞中LC3B、p62及AMPK蛋白表達

HL-7702細胞長至對數(shù)生長期，調整細胞密度為3×106/mL，接種于6孔板中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。按實驗分組及暴露時間干預HL-7702細胞，干預結束后用無菌PBS清洗，每孔加入細胞裂解液200 μL，將6孔板置于冰上10 min，收集各組蛋白，采用BCA法進行蛋白定量。制備分離膠、濃縮膠，上樣，以80 V電壓電泳150 min，使用濕式轉膜法將蛋白轉移至PVDF膜，400 mA電流轉膜60 min。用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗、二抗孵育后加ECL發(fā)光液后于多功能化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)BG-gdsAUTO 720顯影。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件進行蛋白表達的半定量分析。

1.6 HL-7702細胞內ATP含量檢測

按分組暴露時間干預HL-7702細胞。干預結束后，吸棄培養(yǎng)液，冷PBS洗滌細胞，每孔加入200 μL全細胞裂解液。待細胞完全裂解后收集各組細胞裂解液，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min。取離心后上清液按照Beyotime ATP檢測試劑盒說明書檢測ATP水平。在96孔板中，每孔加100 μL ATP檢測工作液，室溫靜置3～5 min，再向各孔中加入20 μL標準品或樣品，立即用移液器混勻后，用化學發(fā)光儀測定相對光單位（relative light unit，RLU）值，根據(jù)標準曲線計算樣品中ATP濃度。每個樣品設3個復孔，將計算得到的ATP濃度換算為蛋白（nmol/mg）形式。

1.7 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)使用SPSS 26.0軟件包進行統(tǒng)計分析，計量資料以表示，多組間比較進行方差齊性檢驗、單因素方差分析；各組間兩兩比較采用Dunnett檢驗。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Na2SO3暴露對HL-7702細胞的毒性作用

結果顯示，與陰性對照組比較，2 h、48 h 0.1 mmol/L Na2SO3暴露組細胞存活率無明顯變化；1、2.5、5 mmol/L Na2SO3暴露組2 h、48 h細胞存活率隨Na2SO3濃度的升高而降低（P＜ 0.05）；陽性對照組細胞存活率也明顯下降（P＜ 0.05）。見表1。

表1 Na2SO3 暴露后各組HL-7702細胞存活率比較Tab.1 Comparison of survival rates of HL-7702 cells in each group after Na2SO3 exposure

2.2 Na2SO3暴露對HL-7702細胞細胞核形態(tài)及LC3B表達的影響

Alexa Fluor 488標記的LC3B在藍色激發(fā)光下呈現(xiàn)綠色熒光，Hoechst33258復染的細胞核在紫外激發(fā)光作用下呈現(xiàn)藍色熒光，Merge為兩者的合并圖。與陰性對照組比較，Na2SO3暴露各組HL-7702細胞中LC3B蛋白的綠色熒光強度在2 h時無明顯變化，而在48 h時0.1、1 mmol/L Na2SO3暴露組熒光強度增加，2.5、5 mmol/L Na2SO3暴露組熒光強度減弱。與陰性對照組比較，陽性對照組HL-7702細胞2 h和48 h時的綠色熒光強度均明顯增加。表明高劑量、長時間Na2SO3暴露可降低HL-7702 細胞中LC3B蛋白的表達，且在較高劑量水平時LC3B蛋白表達水平隨Na2SO3濃度的增加而降低。見圖1。

圖1 Na2SO3暴露2 h、48 h時各組LC3B蛋白表達 ×400Fig.1 LC3B protein expression after sulfite exposure for 2 h and 48 h in each group by immunofluorescence × 400

2.3 Na2SO3暴露對各組HL-7702細胞中蛋白表達的影響

2.3.1 LC3B蛋白表達：與陰性對照組比較，暴露2 h時1、5 mmol/L Na2SO3組LC3B-Ⅱ蛋白表達均明顯增加（P＜ 0.05）；暴露48 h時0.1、1 mmol/L Na2SO3組LC3B-Ⅱ蛋白表達增加（P＜ 0.05）；而2.5、5 mmol/L Na2SO3組LC3B-Ⅱ 表達下降（P＜ 0.05）。與陰性對照組比較，暴露48 h時5 mmol/L Na2SO3組LC3B-Ⅱ 表達下降最明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）。與陰性對照組比較，陽性對照組暴露2 h、48 h時LC3-Ⅱ蛋白表達均明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05），見圖2。

圖2 Na2SO3暴露2 h、48 h時HL-7702細胞中LC3B表達Fig.2 LC3B protein expression after sulfite exposure for 2 h and 48 h in each group

2.3.2 p62蛋白表達：與陰性對照組比較，暴露2 h時 Na2SO3各組p62蛋白表達均明顯增加（P＜ 0.05）；而暴露48 h時 Na2SO3各組，隨著Na2SO3暴露劑量的增加，p62蛋白表達逐漸降低，其中2.5、5 mmol/L Na2SO3組，p62蛋白表達顯著降低（P＜ 0.05）。與陰性對照組比較，陽性對照組48 h p62蛋白表達增加（P＜ 0.05），見圖3。

圖3 Na2SO3暴露2 h、48 h時HL-7702細胞中p62表達Fig.3 p62 protein expression after sulfite exposure for 2 h and 48 h in each group

2.3.3 AMPK蛋白表達：與陰性對照組比較，暴露2 h時 Na2SO3各組AMPKα蛋白表達均無明顯變化，暴露48 h時陽性對照組AMPKα蛋白表達升高（P＜0.05）。見圖4。

圖4 Na2SO3暴露2 h、48 h時HL-7702細胞中AMPKα表達Fig.4 AMPKα protein expression after sulfite exposure for 2 h and 48 h in each group

2.3.4 caspase-3蛋白表達：與陰性對照組比較，暴露2 h時Na2SO3各組caspase-3無明顯變化，活化的caspase-3（cleaved caspase-3）蛋白均未表達。與陰性對照組比較，暴露48 h時 Na2SO3各組caspase-3無明顯變化，而陽性對照組caspase-3表達增加（P＜ 0.05）；1、2.5、5 mmol/L Na2SO3各暴露組cleaved caspase-3表達增加（P＜ 0.05），且呈現(xiàn)濃度依從性；陽性對照組cleaved caspase-3表達增加（P＜ 0.05）。見圖5。

圖5 Na2SO3暴露2 h、48 h時HL-7702細胞中caspase-3表達Fig.5 Caspase-3 protein expression after sulfite exposure for 2 h and 48 h in each group

2.4 Na2SO3暴露對各組HL-7702細胞中ATP含量的影響

結果顯示，與陰性對照組比較，暴露2 h、48 h 時Na2SO3各組ATP含量均顯著升高（P＜ 0.05），見表2。

表2 Na2SO3 暴露2 h、48 h各組HL-7702細胞中ATP含量比較Tab.2 Comparison of ATP content in HL-7702 cells exposed to Na2SO3 at different time points

3 討論

Na2SO3是防止食品變質常用的一種食品添加劑。動物實驗發(fā)現(xiàn)Na2SO3可致小鼠肝損傷和細胞死亡［11］。本研究采用體外實驗模型探討Na2SO3長期暴露效應，結果顯示，1～5 mmol/L Na2SO3各暴露組干預2 h、48 h均可使細胞活力下降，且隨著Na2SO3濃度增加和暴露時間延長細胞存活率逐漸降低，表明較高濃度的Na2SO3暴露可造成肝細胞死亡，且存在劑量時間效應關系。

自噬是真核細胞維持穩(wěn)態(tài)和細胞存活的重要機制，可將聚集的蛋白質或受損的細胞器在溶酶體中蛋白水解酶的控制下降解［12］。LC3B-Ⅱ是自噬體形成的標志，是評估細胞中自噬體數(shù)量的金標準［13］。

本研究免疫熒光結果顯示，48 h LC3B熒光強度先增強后減弱（0.1、1 mmol/L Na2SO3暴露組熒光強度增加，2.5、5 mmol/L Na2SO3暴露組熒光強度減弱），提示高劑量長時間Na2SO3暴露可使HL-7702 細胞中LC3B蛋白表達降低，且高劑量時，蛋白表達水平隨Na2SO3濃度的增加而降低，推測高劑量長時間Na2SO3作用會抑制細胞自噬。Western blotting結果顯示，Na2SO3暴露2 h時，1、2.5、5 mmol/L Na2SO3組LC3B-Ⅱ蛋白表達均明顯增加，說明Na2SO3可促進肝細胞自噬前體的形成及逐步成熟，暴露48 h時隨著Na2SO3濃度的增加，LC3B-Ⅱ蛋白表達先增加后下降，且在5 mmol/L Na2SO3時LC3B-Ⅱ蛋白表達下降最明顯，與免疫熒光結果一致。推測低濃度短時間的Na2SO3暴露促進細胞自噬的發(fā)生，而長時間高劑量Na2SO3暴露抑制自噬的發(fā)生。KOMATSU等［14］研究發(fā)現(xiàn)異常自噬可引起肝損傷，與本研究結果一致。

當自噬途徑正常時，p62將隨自噬降解底物一起降解。當自噬途徑被阻斷時，p62將被累積。過量的p62蛋白可抑制蛋白酶體對泛素化蛋白的降解，大量泛素化蛋白積聚，最終導致細胞死亡［15］。本研究結果顯示，暴露2 h 時Na2SO3各組p62蛋白表達均增加；而暴露48 h 時各組隨著Na2SO3濃度的增加，p62蛋白表達逐漸降低，且在5 mmol/L Na2SO3組下降最明顯，推測其可能的原因是：長時間高濃度Na2SO3暴露引起的自噬已趨于完成，同時增強的自噬作用降解了自噬相關蛋白p62，使p62蛋白表達降低。LC3B作為p62的底物適配器，可招募自噬受體p62。自噬抑制后LC3B表達量下降，此時選擇性自噬發(fā)揮作用，p62也被選擇性自噬降解［16］。陽性對照組在48 h時蛋白表達水平增加，表明CCl4可促進肝細胞自噬。研究［17］表明CCl4可誘導肝損傷，CCl4暴露會損害細胞線粒體，受損線粒體定位到含有LC3的膜上，激活細胞自噬，促進自噬體的形成，隨后自噬體與溶酶體融合，達到清除細胞的目的。本研究結果顯示，暴露48 h 時5 mmol/L Na2SO3與陽性對照組HL-7702細胞內LC3、p62蛋白表達變化不一致，推測可能是Na2SO3與CCl4引起 HL-7702細胞死亡的機制不同所致。

AMPK 是維持體內代謝平衡的關鍵酶，與自噬在不同組織中的活化有關［18］，朱朋飛等［19］研究發(fā)現(xiàn)當細胞缺乏能量（ATP）后，ATP/AMP 下降可以激活 AMPK，AMPK激活時，F(xiàn)OXO3的磷酸化激活自噬基因。本研究嘗試從 ATP和AMPK的變化中去探討Na2SO3暴露引起自噬可能的途徑。結果顯示，隨著Na2SO3暴露劑量的增加，2 h、48 h時HL-7702細胞內ATP增加，而AMPK蛋白表達無明顯變化；本研究未檢測到磷酸化AMPK的表達，提示短時間低劑量Na2SO3暴露引發(fā)的肝細胞自噬過程的增強并不是由于ATP合成受到抑制，反饋性誘導AMPK的激活所導致。因此推測 Na2SO3暴露引起的肝細胞自噬異?？赡懿皇峭ㄟ^AMPK途徑，而ATP的持續(xù)升高可能是由于自噬本身降解了底物所產生的，或者是細胞功能活動受到抑制而ATP消耗減少所致，但具體的機制還有待進一步研究。

自噬與細胞凋亡密切相關，本研究測定了凋亡相關蛋白caspase-3的表達水平，結果顯示，暴露2 h、48 h時Na2SO3各組caspase-3表達無明顯變化，但Na2SO3暴 露48 h后，1、2.5、5 mmol/L Na2SO3組cleaved caspase-3增加，且cleaved caspase-3表達水平隨著Na2SO3濃度增加而增加，推測高濃度長時間Na2SO3暴露可促進細胞凋亡。

綜上所述，高濃度（5 mmol/L）Na2SO3暴露能抑制HL-7702細胞自噬，促進細胞凋亡。其作用機制可能是通過降低LC3B和p62蛋白表達來實現(xiàn)的。細胞中自噬、死亡及細胞凋亡等多種模式同時發(fā)生，并可相互串擾和重疊。本研究尚無法明確Na2SO3暴露引起的細胞凋亡與自噬之間的關系是相互促進還是相互拮抗，推測自噬抑制可能是其引起細胞死亡的機制之一。希望今后進一步明確Na2SO3暴露引起肝損傷的效應機制。