郭文海,顏敬彧,邢 菁,陳 奧,徐 佳,馬伯艷,史珊怡△

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001；2.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是以進行性的記憶和認知功能障礙為特征，是最常見的老年期癡呆[1]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù)統(tǒng)計，AD占所有癡呆類型的60 %～70 %，是癡呆的主要類型[2]。在我國，AD以發(fā)病隱襲、病情進展性加重以及有效治療手段缺乏等特點居于社會疾病之首[3]。目前主流學說認為AD相關的病理生理學改變?yōu)橥挥|損傷或突觸功能減弱。而谷氨酸作為大腦中主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)之一，其神經(jīng)傳遞對于神經(jīng)細胞可塑性以及學習、記憶具有根本作用。N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate receptor,NMDAR)是谷氨酸受體的主要亞型，其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中高度表達，過度活化會導致神經(jīng)元不可逆的損傷。NMDAR作為導致神經(jīng)退行性疾病如AD的主要因素之一，已被研究多年。而與其相關的膜定位和區(qū)域化信號可能是AD相關病理生理學的關鍵[4]?，F(xiàn)代研究提示NMDAR通道功能的異常變化與在AD患者中觀察到的神經(jīng)毒性和變性相關，最終結果為導致與AD相關的神經(jīng)退行性變[5-7]。本研究擬觀察“原絡通經(jīng)”針法對SAMP8小鼠海馬CA-1區(qū)病理形態(tài)學及NMDAR表達水平變化的影響，初步探討“原絡通經(jīng)”針法治療AD的潛在作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級SAMP8雄性8月齡小鼠30只，SAMR1 小鼠10只，上述40只小鼠體質(zhì)量約30～35 g，購于北京大學醫(yī)學部(實驗動物科學部)，許可證號：SCXK(京)2016-0010。將實驗動物置于清潔級環(huán)境下，予自由攝食飲水的喂養(yǎng)方式，保持環(huán)境溫度20～26 ℃，濕度40 %～70 %。將30只SAMP8雄性8月齡小鼠隨機分為SAMP8空白對照組、SAMP8+“原絡通經(jīng)”針法治療組以及SAMP8+百會穴針刺組，將10只SAMR1小鼠作為SAMR1正常對照組。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器 華佗牌針灸針(0.30 mm×25 mm，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)；水迷宮(JLBehv-MWMG,上海玉研科學儀器有限公司)；藥品冷藏柜(BYC-310,山東博科生物)；電熱恒溫鼓風干燥箱(HGZF-101-1,上海躍進醫(yī)療器械有限公司)；顯微鏡(BX43,OLYMPUS)；切片機(2235,Leica)；超高靈敏度化學發(fā)光成像系統(tǒng)[Chemi DocTM XRS+,伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品(上海)有限公司]。

1.2.2 試劑 蘇木素染液(19120302,中衫金橋)；伊紅染色液(E607321,Sangon Biotech)；超凈高級封片膠(YZB,BASO)；Scott藍化液(G1865,Solarbio)；RIPA細胞裂解液(C1053, 北京普利萊基因技術有限公司)；BCA蛋白定量試劑盒(CW0014S, 康為世紀)；Marker(#26617,Thermo)；PVDF膜(IPVH00010, Millipore)；封閉專用脫脂奶粉(P1622,北京普利萊基因技術有限公司)；內(nèi)參一抗：Mouse Monoclonal Anti-GAPDH (TA-08,中杉金橋, 1/2000);二抗：辣根酶標記山羊抗鼠IgG(H+L)(ZB-2305,中杉金橋,1/2000)。

1.3 實驗方法

1.3.1 針刺干預方法 實驗動物選穴定位參照《實驗針灸學》進行取穴[8]，其中太白穴參照《針灸學》中人體定位并結合小鼠解剖學特征進行取穴，定位于足內(nèi)側(cè)緣，第1跖趾關節(jié)后下方赤白肉際凹陷處。SAMR1正常對照組(SAMR1)：正常飼養(yǎng)，不進行針灸，但要與SAMP8+“原絡通經(jīng)”針法治療組(SAMP8 Yuanluo Tongjing)和SAMP8+百會穴針刺組(SAMP8 Baihui)進行相同程度的捉抓。SAMP8空白對照組(SAMP8 NC)同上。SAMP8+“原絡通經(jīng)”針法治療組:針刺豐隆穴、太白穴、關元穴與百會穴,其中豐隆直刺1 mm，太白直刺1 mm，關元向恥骨聯(lián)合方向呈45 °斜刺1.5 mm，百會向前斜刺2 mm,穴位分別施幅度：90 °～180 °，頻率：60～120 r/min，捻轉(zhuǎn)法30 s。SAMP8+百會穴針刺組:針刺百會穴，針刺手法、角度同SAMP8+“原絡通經(jīng)”針法治療組。SAMP8+“原絡通經(jīng)”針法治療組和SAMP8+百會穴針刺組兩組1次/d，持續(xù)30 d，每7 d休息1次。

1.3.2 Morris水迷宮行為學測定 分別于實驗前及實驗結束后(第30天)對40只小鼠進行為期7 d的Morris水迷宮行為學測定:①適應階段。水迷宮主要由1個直徑0.9 m、高0.5 m的不銹鋼圓柱形水池和1個位置可移動的直徑9 cm、高28 cm的平臺組成。預先在水池里注入清水達30 cm深，使水面髙出平臺1 cm，將水溫控制在(24±1)℃，并在水中加入黑色墨水。將平臺置于圓柱形水池第二象限的中間，整個實驗過程平臺位置保持不變。攝像頭置于水池中央的上方約2 m處，自動采集和圖像分析系統(tǒng)自動記錄動物的游泳路徑和搜索策略，以及逃避潛伏期、游泳距離、平均速度、初始角度與不同象限的停留時間等參數(shù)。②定位航行階段。依次將小鼠從4個象限的入水點處使其頭朝向池壁入水，記錄其找到平臺的時間(定向航行潛伏期)。若小鼠在90 s內(nèi)尚未找到平臺，則將其引至平臺，并讓小鼠在平臺上停留30 s，然后進行下一象限訓練。實驗一共進行5 d(次)，比較第1～5天小鼠的逃避潛伏期。③空間探索階段。定位航行實驗結束24 h后，撤去平臺，在圓柱形水池第二象限將小鼠面向池壁放入水中，比較4組小鼠穿越平臺次數(shù)及其在目標象限停留時間。小鼠2象限時間、路程占比以及站臺范圍1時間越長表示小鼠空間記憶能力越好。

1.3.3 新物體識別實驗 實驗前7 d，實驗人員每天定時撫摸小鼠5 min以緩解其緊張狀態(tài):①自由探索階段(T1)：于實驗當天，將小鼠單獨放入敞開的、底邊長33 cm×33 cm 的方形行為箱中，自由探索5 min。階段結束后將小鼠取出放回飼養(yǎng)籠，清理箱中殘留的糞尿并用75 %酒精擦拭。②相同物體階段(T2)：于T1階段結束后24 h開始，在行為箱中放入兩個完全相同的物體(物體1和1’) ，再次將小鼠放入行為箱中探索5 min。每次實驗結束后，清理箱中殘留的糞尿并用75 %酒精擦拭。③替換物體階段(T3)：于T2階段結束后1 h開始，物體1保持不變，替換物體1’為大小相近的物體2，再次將小鼠放入行為箱中探索5 min。每次實驗結束后，清理箱中殘留的糞尿并用75 %酒精擦拭。分別記錄T2階段以及T3階段中小鼠對兩個物體的探索時間，其中探索物體1的時間記為F，探索物體1’或2的時間記為N，計算小鼠對物體1’和2的分辨比(Discrimination ratio，DR)，計算公式為DR=N/(N+F)×100 %。將小鼠面向物體，其頭部與該物體的間距≤2 cm定義為探索。

1.3.4 海馬區(qū)病理損傷程度檢測 ①取出組織，經(jīng)流水沖洗數(shù)小時后，分別置入70 %、80 %和90 %的各級乙醇溶液中脫水，隨后依次放入純酒精及二甲苯等量混合液15 min、二甲苯Ⅰ15 min以及二甲苯Ⅱ15 min，直至透明為止;②放入二甲苯和石蠟各半的混合液中15 min，再放入石蠟Ⅰ及石蠟Ⅱ透蠟中各50～60 min;③石蠟包埋、切片，將石蠟切片進行烤片，然后脫蠟、水化;④將已入蒸餾水后的切片放入蘇木精水溶液中染色3 min，隨后放入鹽酸乙醇分化液中分化15 s，后經(jīng)水洗返藍15 s。流水沖洗后，應用伊紅染色液染色3 min;⑤流水沖洗后，進行脫水、透明和封片，最后鏡檢。

1.3.5 海馬區(qū)NMDAR表達水平檢測 ①取小鼠海馬經(jīng)液氮研磨成粉末，加入裂解液后再次研磨，將組織勻漿吸入EP管中,經(jīng)冰上裂解30 min、12 000 rpm離心10 min后，吸取上清以獲得總蛋白并測定蛋白濃度;②將蛋白變性，上樣,經(jīng)十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳(SDS-PAGE)2 h;③應用300 mA恒流轉(zhuǎn)膜80 min;④將蛋白膜放置到預先準備好的Western洗滌液中漂洗1～2 min，隨后用微型臺式真空泵吸盡洗滌液，加入Western封閉液，在搖床上緩慢搖動，室溫封閉60 min;⑤一抗溶液孵育，4 ℃下過夜;⑥二抗溶液孵育，室溫下2 h;⑦在膜上滴加ECL曝光液，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。用“ImageJ”軟件分析各抗體條帶灰度值。

2 實驗結果

2.1 小鼠學習記憶能力變化情況

SAMR1和SAMR8小鼠在Morris水迷宮行為學測定后判斷各編號小鼠學習能力，包括定位航行潛伏期、分組后定位穿越平臺平均速度,見圖1。實驗結果顯示，與SAMR1正常對照組比較，各SAMP8組小鼠定位航行潛伏期明顯延長，定位穿越平臺平均速度、2象限時間占比及路程占比、站臺范圍1時間明顯降低(P<0.05)。與SAMP8空白對照組比較，SAMP8+“原絡通經(jīng)”針法治療組小鼠2象限時間占比及路程占比、站臺范圍1時間明顯增加(P<0.05);SAMP8+百會穴針刺組小鼠2象限時間占比及路程占比明顯增加(P<0.05)。且與單獨針刺百會穴比較，“原絡通經(jīng)”針法在增加其2象限時間占比及路程占比、站臺范圍1時間方面效果更顯著(P<0.05)。見圖1、表1。

表1 各組小鼠學習記憶能力變化情況

2.2 小鼠新物體識別實驗的變化情況

實驗結果顯示，干預后的SAMP8+“原絡通經(jīng)”針法治療組和SAMP8+百會穴針刺組在新物體探索時間以及分辨比兩個方面均優(yōu)于SAMP8空白對照組(P<0.05)。與SAMP8+百會穴針刺組比較，SAMP8+“原絡通經(jīng)”針法治療組在提升新物體探索時間以及提高分辨比兩個方面比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組小鼠新物體探索時間以及分辨比

2.3 小鼠腦海馬組織中 NMDAR 的表達情況

實驗結果顯示，與SAMP8空白對照組比較,SAMP8+“原絡通經(jīng)”針法治療組和SAMP8+百會穴針刺組中NMDAR表達水平顯著降低。見圖2、表3。

表3 各組小鼠腦海馬組織中NMDAR的表達情況

2.4 小鼠腦海馬組織HE染色

取各組小鼠海馬組織進行HE病理染色，SAMP8對照組出現(xiàn)核皺縮，出現(xiàn)空泡。SAMP8+“原絡通經(jīng)”針法治療組和SAMP8+百會穴針刺組于干預后沒有出現(xiàn)嚴重的病理問題。見圖3。

3 討論

AD是最常見的老年期認知障礙疾病之一，其主要臨床表現(xiàn)為認知功能障礙，病程多呈進行性加重?，F(xiàn)有研究提示，NMDAR電生理功能異常導致谷氨酸攝取及再循環(huán)系統(tǒng)的嚴重削弱，被認為與AD中觀察到的神經(jīng)毒性和變性密切相關[4]。作為谷氨酸能神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)重要的組成部分，NMDAR在突觸功能和可塑性方面發(fā)揮了重要作用[9-10]，對AD患者LTP的建立也有重大影響[11]。在AD的病理學機制中，NMDAR受Aβ影響進而導致谷氨酸能神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)調(diào)節(jié)機制解除，其最終結果是AD患者在認知、學習和記憶等方面出現(xiàn)功能障礙。有多項研究指出，谷氨酸攝取/再循環(huán)機制的損害會導致NMDAR供應增強，進而導致AD相關的興奮性毒性和神經(jīng)退行性變[12-14]。因此涉及NMDAR的治療途徑可能在AD的防治中發(fā)揮重要作用[15]。

AD屬于中醫(yī)學 “呆病” “善忘”等范疇。中醫(yī)理論認為本病病因病機為腎虛髓虧、痰瘀閉阻腦絡以致神志靈機失用，即所謂“腦為元神之府，精髓之海……老人健忘者，腦漸空也”。臨床中治法多圍繞補腎益髓、活血化痰以及醒腦益智?！霸j通經(jīng)”針法是腦血管病專家孫遠征教授在臨床實踐中總結出的治療認知功能障礙的有效方法，具有祛瘀通絡、補腎填精之功效[16]。原穴是臟腑原氣輸注、經(jīng)過和留止于十二經(jīng)脈四肢部的腧穴；絡穴是表里經(jīng)聯(lián)系的穴位，通經(jīng)是指激發(fā)疏通十二經(jīng)經(jīng)氣?！岸矫}為陽脈之海，總督諸陽經(jīng)，通于腦”“任脈為陰脈之?！保^為諸陽之會，故以任督二脈及陽經(jīng)穴為主交通陰陽，協(xié)調(diào)十四經(jīng)。關元為三陰經(jīng)與任脈之會，配以百會則更添行氣通經(jīng)之效。同時選擇太白-豐隆(脾經(jīng)原穴-胃經(jīng)絡穴)，配合一定的針刺補瀉手法，達到補虛瀉實的治療目的，正應“脾主運化，為后天之本”的中醫(yī)理論。前期多個研究顯示原絡通經(jīng)針法單獨使用或聯(lián)合西藥、中藥對血管性癡呆、輕度認知功能障礙等多種認識功能障礙均有較好療效[17-19]。

Morris水迷宮比較實驗結果顯示，與SAMR1正常對照組比較，各SAMP8組小鼠定位航行潛伏期明顯延長，定位穿越平臺平均速度、2象限時間占比及路程占比、站臺范圍1時間明顯降低，提示模型組小鼠出現(xiàn)學習記憶能力減退的老化性病態(tài)特征。而與SAMP8空白對照組比較,SAMP8+“原絡通經(jīng)”針法治療組2象限時間占比及路程占比、站臺范圍1時間明顯增加，提示在“原絡通經(jīng)”針法干預下，SAMP8小鼠學習認知功能得到明顯改善。且與單獨針刺百會穴比較，“原絡通經(jīng)”針法在增加其2象限時間占比及路程占比、站臺范圍1時間方面效果更顯著，提示在改善學習記憶能力方面“原絡通經(jīng)”針法優(yōu)于單獨應用百會穴。

新物體識別實驗結果顯示，干預后的SAMP8+“原絡通經(jīng)”針法治療組和SAMP8+百會穴針刺組在新物體探索時間以及分辨比兩個方面均優(yōu)于SAMP8空白對照組。與SAMP8+百會穴針刺組比較，SAMP8+“原絡通經(jīng)”針法治療組在提升新物體探索時間以及提高分辨比兩個方面比較差異無統(tǒng)計學意義。新物體識別實驗主要用于檢查動物對物體的識別記憶能力，其原理是動物依照物體的相關特征以學習、記憶其相關信息，并建立在動物對新物體自行探索的基礎上，具體指在對新奇物體接近、探索的時間更多。本實驗結果說明在“原絡通經(jīng)”針法和百會穴針刺干預下，SAMP8小鼠對物體的辨識能力有顯著提升。

而HE病理染色結果顯示，SAMP8空白對照組出現(xiàn)核皺縮及空泡，而SAMP8+“原絡通經(jīng)”針法治療組和SAMP8+百會穴針刺組在治療后未出現(xiàn)嚴重的病理問題，提示“原絡通經(jīng)”針法和百會穴針刺能有效改善SAMP8小鼠海馬組織病理形態(tài)學損傷。同時，WB檢測結果顯示 “原絡通經(jīng)”針法和百會穴針刺均能顯著降低NMDAR表達水平，提示“原絡通經(jīng)”針法可顯著提高突觸可塑性從而改善學習認知功能，但兩種針刺組在降低NMDAR表達水平方面無顯著差異。

綜上所述，“原絡通經(jīng)”針法能有效改善SAMP8小鼠的海馬組織病理形態(tài)學改變及海馬組織神經(jīng)元損傷，改善其學習記憶能力，以起到防治AD的作用，機制可能是降低NMDAR蛋白的表達水平、抑制其過度活化，并改善其通道功能的異常變化。