王曉慧，孫雙姣，曾立，張運良，李成艦，黃春花

(1.邵陽學院 藥學院，湖南 邵陽，422000；2.湘西南中藥開發(fā)利用湖南省工程研究中心，湖南 邵陽，422000)

天然植物護膚品以其作用溫和、副作用小、毒性低等優(yōu)點，備受消費者的青睞?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》將白茯苓列為“上品”、白芷列為“中品”。研究證明:白芷揮發(fā)油中的雙鍵類化合物具有抑制酪氨酸酶活性ER[1-4]。白術中的揮發(fā)油具有抑制黑色素的作用，可以預防色素在皮膚表面沉積，從而達到祛斑美白、美容養(yǎng)顏功效[5]。白茯苓無水乙醇提取液對酪氨酸酶的抑制率為91.7%，具有較好的防止黑色素沉積作用[3]。本研究中，提取白芷、白術、白茯苓中的美白活性成分，將其制成水溶性凝膠，考察制劑的穩(wěn)定性、體外抗氧化活性、酪氨酸酶抑制活性、抗紫外線性能、保濕性能及美白效果，與對照品蘆薈美白祛斑保濕凝膠進行對比評價。

1 儀器與試藥

1.1 試藥

白芷、白術、白茯苓(飲片，邵東廉橋藥材市場，60 ℃恒溫干燥后，磨粉過0.3 mm篩，備用)；蘆薈美白祛斑保濕凝膠(對照品，無錫市翔之錦商貿有限公司)；DPPH 標準品(北京中科質檢生物技術有限公司)；卡波姆 940(西安天正藥用輔料有限公司)；三乙醇胺(西隴科學股份有限公司)；熊果苷(上海軒轅生物科技有限公司)；甲醇、乙醇(AR，天津市永大化學試劑有限公司)；其他試劑為分析純或化妝品常用原料，水為二次去離子水。

1.2 儀器

紫外可見分光光度計(Spectrumlab752pro，上海棱光技術有限公司)，電子分析天平(CP214，奧豪斯儀器(常州)有限公司，旋轉蒸發(fā)儀(RE-52系列，上海亞榮生化儀器廠)，高速多功能粉碎機(HC-800Y，武義海納電器有限公司)，超聲波清洗機(KQ-500B，昆山市超聲儀器有限公司)，高速離心機(H1850，湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司)，恒溫磁力加熱攪拌器(78HW-1，常州榮華儀器制造有限公司)。

2 方法與結果

2.1 活性物質的提取

2.1.1 白芷提取原液的制備

白芷原液參照徐廣等[1]的方法，采用水蒸氣蒸餾法提取。流出液甲醇溶解后加水稀釋成為0.01 mL/mL的白芷原液。

2.1.2 白術、白茯苓提取原液的制備[6]

超聲輔助乙醇回流提取，白術、白茯苓質量濃度均控制為1.0 g/mL。

2.2 “三白”凝膠的基礎制備

參照孫淑萍[5]的方法制備。

2.3 數(shù)據(jù)處理

2.4 凝膠處方的優(yōu)化

2.4.1 單因素分析

初步選定A、B、C3個影響因素六水平，以綜合指數(shù)值(對DPPH自由基的去除率的50%+對酪氨酸酶活性抑制率的50%)為考察指標，單因素分析確定因素的響應值。因素-水平表見表1。各因素對綜合評價值的影響結果見圖1。

表1 因素-水平表(單因素分析)Table 1 Factors-level table (single factor analysis)

圖1 各因素對綜合指數(shù)的影響Fig.1 Influence of various factors on composite index

圖1顯示，白芷、白術、白茯苓提取液均在5.0 mL 達到滿意綜合效果，增加劑量并不增效，這說明已經(jīng)達到白芷、白術、白茯苓活性成分的清除極限。表明白芷、白術、白茯苓活性成分的抗氧化活性存在飽和性。

2.4.2 正交設計試驗

正交試驗因素與水平見表2，試驗結果見表3。數(shù)據(jù)均由SPSS 23進行統(tǒng)計處理，方差分析見表 4。

表2 正交設計試驗因素與水平Table 2 Factors and levels (Orthogonal design experiment)

表3 正交設計L9(34)試驗結果Table 3 Experimental results of orthogonal design L9(34)

通過直觀分析最優(yōu)處方方案為C2A3B2，其主次影響因素的順序為C>A>B；正交設計結果與直觀分析相符，主體間效應檢驗比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。白芷提取原液體積5.0 mL、白術提取原液體積5.0 mL白茯苓提取原液體積5.0 mL時，為最優(yōu)制備工藝參數(shù)。

2.4.3 驗證性試驗

按照C2A3B2方案，即取處方量的白芷提取原液、白術、白茯苓提取原液各5.0 mL，平行制備3份，綜合指數(shù)結果見表5。

表5 驗證性試驗結果(n=3)Table 5 Confirmatory experimental results(n=3) %

表5顯示，正交設計優(yōu)化的制備工藝穩(wěn)定可靠，質量可控。

2.5 “三白”保濕美白凝膠的功能性測定[7-8]

2.5.1 樣品供試液的配制

分別稱取“三白”凝膠、蘆薈美白祛斑保濕凝膠各5 g，高速離心(10 000 r/min)后吸出上清液5 mL，蒸餾水稀釋定容至100 mL。

2.5.2 對DPPH自由基的清除率測定[6]

精密移取樣品供試液2 mL、質量濃度為20 μg/mL二苯基苦基苯肼(DPPH)溶液2 mL，先后加入同一具塞試管中搖勻，在暗室處、室溫下靜置30 min，然后在517 nm波長下測定樣品的吸光度Ac。按以下公式(1)計算樣品對DPPH自由基的清除率(K)

K=[1-Ai/Ac]×100%

(1)

式中：Ai為DPPH溶液和樣品供試液混合液的吸光度;Ac為DPPH溶液的吸光度，并作F檢驗。試驗結果顯示：“三白”凝膠和蘆薈美白祛斑保濕凝膠對DPPH自由基的清除率分別為(78.26±0.36)%和(58.69±0.18)%,兩組比較，P<0.05。

2.5.3 對酪氨酸酶抑制活性測定[3]

按照表6步驟依次加入PBS(pH=6.8)、樣品供試液、酪氨酸溶液(1.0 mg/mL)，35 ℃水浴10 min后加入1.0 mL的酪氨酸酶溶液，搖勻，快速轉移至比色管中，于475 nm處測定吸光度A。

表6 酪氨酸酶抑制活性測定試劑使用量Table 6 Use of reagent for determination of tyrosinase inhibitory activity mL

按公式(2)計算對酪氨酸酶的抑制率(I)

(2)

式中：A1～A4為測試樣組1～4號在475 nm處的吸光度值。試驗結果顯示：“三白”凝膠和蘆薈美白祛斑保濕凝膠對酪氨酸酶活性的抑制率分別為(55.89±0.12)%和(36.77±0.26)%,兩組比較，P<0.05。

“三白” 凝膠與蘆薈美白祛斑保濕凝膠對DPPH自由基的清除率和對酪氨酸酶活性的抑制率比較差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。

2.5.4 抗紫外線性能測定

按照QB/T 2410—1998規(guī)定的防曬霜UVB區(qū)防曬效果的評定方法[9-10]，分別稱取“三白”保濕美白凝膠、市售蘆薈美白祛斑保濕凝膠各2 g，均勻涂抹在3M醫(yī)用透氣膠帶上，貼于比色皿內壁，以樣品的醫(yī)用透氣膠帶為參比，波長在280～360 nm范圍內，每隔10 nm掃描一次，記錄吸光度A，以吸光度平均值來判斷樣品在UVB區(qū)(280～320 nm)的防曬效果。結果見表7。

表7 抗紫外線性能測定結果Table 7 Measurement results of uv resistance

表7顯示，“三白”凝膠與蘆薈美白祛斑保濕凝膠抗紫外線性能差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，可以用于中等紫外線照射的防護。

2.5.5 保濕率測定

室溫條件下，將2.0g凝膠直接均勻涂布在醫(yī)用透氣膠帶(模仿真人皮膚)上，精確記錄質量W0。然后，將其置于相對濕度為45%和80%的干燥器內，分別于4、8、12和24h后取出透氣膠帶，立即精確稱取各樣品質量，記錄為Wi，按以下公式(3)計算保濕率(φ)。結果見表8。

(3)

表8 凝膠體外保濕效果Table 8 Results of gel in vitro moisturizing experiment

表8顯示，8～24h內，在相對濕度45%和80%的環(huán)境下，“三白”凝膠與蘆薈美白祛斑保濕凝膠的保濕率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.6 性能表征考察

2.6.1 外觀性狀

本品為白色凝膠，質地細膩均勻，透亮、黏稠度適宜，涂展性良好。

2.6.2pH值檢測

取本品供試液，pH值測定值為6.8。

2.6.3 冷熱試驗

將本品封裝于透明化妝品瓶中，分別置于4、25和50 ℃下，于第7、30和180天取樣觀察，凝膠外觀無分層、結塊、霉變、變色現(xiàn)象。

2.6.4 離心試驗

將本品封裝于離心試管中，2 000r/min，于5、10和15min取樣觀察，凝膠外觀無分層、結塊現(xiàn)象。

2.6.5 強光照射試驗

將本品敞開口放在裝有光照度為4 500lx日光燈的光櫥內15d，第7、15天取樣檢測，凝膠的透明度、酸堿度、黏稠度均無變化。

2.6.6 留樣觀察

將樣品裝入包裝盒內加蓋密閉，于室溫下放置 1個月，按質量標準檢測，結果無明顯變化。

3 結論

在普通凝膠制備的工藝基礎上，添加白芷、白術、白茯苓美白活性提取成分，開發(fā)了一款新型的“三白”美白凝膠。經(jīng)測試，凝膠質地細膩均勻、透亮、黏稠度適宜、涂展性良好。除保濕率與對照品蘆薈美白祛斑保濕凝膠相似，對DPPH自由基的清除率和對酪氨酸酶活性的抑制率均較高于對照品市售蘆薈保濕美白凝膠，為一款比較理想的美白保濕護膚品。