劉星，劉小梯，符秋紅，陳學(xué)東

(1.深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院，廣東 深圳，518110；2.邵陽(yáng)學(xué)院 醫(yī)學(xué)部，湖南 邵陽(yáng)，422000)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常見的肝癌病理類型，是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因，長(zhǎng)期預(yù)后差及死亡率高是其主要特點(diǎn)[1-2]。雖然HCC的診斷和治療水平有了較大提高，但由于對(duì)其復(fù)雜的分子發(fā)病機(jī)制認(rèn)識(shí)不足，難以避免HCC的頻繁復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[3-4]。因此，進(jìn)一步闡明HCC惡性腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)機(jī)制，有利于制定更有效的治療策略。

人類基因組研究表明約90%的人類基因組DNA序列能夠被轉(zhuǎn)錄，在這些轉(zhuǎn)錄本中只有約2%的轉(zhuǎn)錄本能夠編碼并翻譯成蛋白質(zhì)，而其余較多不能編碼并翻譯為蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄本則被稱為非編碼RNA(noncoding RNAs,ncRNAs)[5]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs,lncRNAs)和微RNA(microRNAs，miRNAs)是非編碼RNA的主要組成部分[6]。IncRNA的特點(diǎn)是長(zhǎng)度超過200 bp核苷酸且沒有蛋白質(zhì)編碼功能，其在多種惡性腫瘤中調(diào)控腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移[7]。例如，lncRNA TMPO-AS1可調(diào)控食管癌細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)過程[8]。IncRNA AGAP2-AS1作為miR-4668-3p的競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)源性RNA(ceRNA)，誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞的EMT過程[9]。IncRNA ZNFX1-AS1作為miR-144的ceRNA調(diào)控EZH2的表達(dá)，并促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[10]。

IncRNA OIP5-AS1位于人類15號(hào)染色體上，多項(xiàng)研究證實(shí)它在多種人類疾病中發(fā)揮重要作用，其中較多的是惡性腫瘤。有研究報(bào)道lncRNA OIP5-AS1通過AKT /NF-κB通路靶向miR-26a-5p，從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展[11]；lncRNA OIP5-AS1可通過miR-448/PON1軸和TLR3/NF-κB信號(hào)通路的失活來緩解類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎進(jìn)展[12]。在腫瘤的研究中證實(shí)lncRNA OIP5-AS1通過調(diào)節(jié)miR-137/ZNF217信號(hào)軸調(diào)控卵巢癌進(jìn)展[13]；lncRNA OIP5-AS1通過靶向miR-429/FOXD1/ERK通路在胰腺癌細(xì)胞中發(fā)揮致癌作用[14]。但lncRNA OIP5-AS1/miR-217/USP7分子軸調(diào)控肝癌細(xì)胞的EMT 及侵襲遷移機(jī)制的研究目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道。本研究旨在探討lncRNA OIP5-AS1通過調(diào)控miR-217/USP7分子軸進(jìn)而影響肝癌細(xì)胞的EMT 及侵襲遷移過程的機(jī)制，為肝癌的診治提供新的靶標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 細(xì)胞株及主要試劑

正常肝細(xì)胞株HL-7702及肝癌細(xì)胞株(MHCC97H，Hep3B，HepG2和HCCLM3)購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)賽默飛公司；青霉素、鏈霉素和雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；轉(zhuǎn)染試劑盒 Lipofectamine?3000、PrimeScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒TB GreenTMPremix Ex TaqTMII均購(gòu)于日本TaKaRa 公司； TRIzol-Reagent購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司；N-cadherin，Vimentin，E-cadherin，USP7和GAPDH一抗購(gòu)于Proteintech中國(guó)公司；辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記二抗均購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Transwell實(shí)驗(yàn)用侵襲小室購(gòu)于美國(guó)康寧公司；蛋白質(zhì)印跡及IP蛋白裂解液均購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；實(shí)驗(yàn)中涉及到的質(zhì)粒、干擾片段、miRNA的模擬物和抑制劑均委托上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成。

1.2 方法

1.2.1 sh-lncRNA OIP5-AS1，shOIP5-AS1-1與shOIP5-AS1-2質(zhì)粒以及miR-217 3′ UTR熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)lncRNA OIP5-AS1基因組序列和質(zhì)粒載體多克隆酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)lncRNA OIP5-AS1上下游引物，同時(shí)針對(duì)lncRNA OIP5-AS1剪切位點(diǎn)不同設(shè)計(jì)shOIP5-AS1-1與shOIP5-AS1-2引物序列，設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增針對(duì)mRNA 3′ UTR區(qū)域DNA序列。通過PCR擴(kuò)增目的基因，提取目的基因和質(zhì)粒DNA、雙酶切、T-A連接、轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞等構(gòu)建sh-lncRNA OIP5-AS1，shOIP5-AS1-1與shOIP5-AS1-2質(zhì)粒載體和空白對(duì)照質(zhì)粒同時(shí)構(gòu)建熒光素酶基因共表達(dá)的miR-217 靶向mRNA 3′ UTR嵌合基因共表達(dá)質(zhì)粒載體。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

正常肝細(xì)胞HL-7702及肝癌細(xì)胞株(MHCC97H，Hep3B，HepG2和HCCLM3)用含有10%FBS，100 U/mL青霉素和100 g/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基置于恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)中培養(yǎng)，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌細(xì)胞以2×105個(gè)/孔的密度接種到6 孔板中，按照轉(zhuǎn)染試劑盒 Lipofectamine?3000說明書將相應(yīng)的質(zhì)粒、干擾片段及模擬物分別轉(zhuǎn)染至分組的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞中，通過qRT-PCR和蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。

1.2.3 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)lncRNA OIP5-AS1和miR-217的表達(dá)

用TRIzol法提取細(xì)胞中RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取RNA的濃度及純度。按照TaKaRa PrimeScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的步驟對(duì)提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄以制備cDNA，按照TB GreenTMPremix Ex TaqTMII試劑盒說明書的步驟檢測(cè)lncRNA OIP5-AS1和miR-217的表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)以GAPDH和U6為內(nèi)參對(duì)照。每個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，每組獨(dú)立實(shí)驗(yàn)均至少重復(fù)3 次。相應(yīng)基因的qRT-PCR引物序列見表1。

表1 正向和反向引物的序列Table 1 Sequence of forward and reverse primers

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)N-cadherin，Vimentin，E-cadherin和USP7表達(dá)

采用蛋白質(zhì)印跡法及IP裂解液提取細(xì)胞中的總蛋白質(zhì)，通過BCA法檢測(cè)并定量蛋白質(zhì)濃度，分別取等量蛋白質(zhì)經(jīng)充分煮沸變性后采用10% SDS-PAGE電泳(80 V，120 min)分離蛋白質(zhì)；電轉(zhuǎn)膜法將電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫條件下封閉1 h；加入目的條帶相應(yīng)的一抗(體積稀釋比例均為1∶1 000)，4 ℃孵育反應(yīng)過夜；TBST洗膜3次，10 min/次，加入相應(yīng)屬性HRP標(biāo)記二抗(體積稀釋比例均為1∶2 000)室溫條件下孵育1 h；TBST洗膜3次，10 min/次；最后利用化學(xué)發(fā)光凝膠成像分析儀觀察N-cadherin，Vimentin，E-cadherin和USP7的蛋白表達(dá)情況。

1.2.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝癌細(xì)胞遷移和侵襲能力

取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的肝癌細(xì)胞，胰酶消化后用無血清培養(yǎng)基重懸至適當(dāng)細(xì)胞濃度，在進(jìn)行遷移實(shí)驗(yàn)時(shí)，Transwell上室中加入200 μL無血清細(xì)胞懸液，Transwell下室中加入600 μL含有20%血清的培養(yǎng)基，置于恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)中培養(yǎng)24 h，棄除所有的培養(yǎng)基后甲醛固定30 min，用棉簽擦除上室中未發(fā)生遷移的細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫染色，清洗并干燥后在顯微鏡下拍照并計(jì)數(shù)。在進(jìn)行侵襲實(shí)驗(yàn)時(shí)，需提前在Transwell上室底部預(yù)鋪Matrigel基質(zhì)膠，其余操作與遷移實(shí)驗(yàn)一致。

1.2.6 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證lncRNA OIP5-AS1、miR-217和USP7的靶向關(guān)系

取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的肝癌細(xì)胞按照細(xì)胞傳代的方法接種至24 孔板中，構(gòu)建lncRNA OIP5-AS1和USP7pmirGLO熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體，獲得lncRNA OIP5-AS1，USP7野生型載體(pmirGLO-lncRNA OIP5-AS1-WT/pmirGLO-USP7-WT)以及l(fā)ncRNA OIP5-AS1，USP7突變載體(pmirGLO-lncRNA OIP5-AS1-MUT/pmirGLO-USP7-MUT)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組將相應(yīng)的質(zhì)粒和模擬物按照細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染至接種好的細(xì)胞中，恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)中培養(yǎng)48 h，按照雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)試劑盒的操作說明，用酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光素酶活性。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 IncRNA OIP5-AS1在肝癌細(xì)胞系中高表達(dá)

qRT-PCR結(jié)果顯示：與正常肝細(xì)胞HL-7702比較，lncRNA OIP5-AS1在肝癌細(xì)胞系中均呈明顯高表達(dá)(P<0.05或P<0.01，圖1)，且在MHCC97H細(xì)胞中表達(dá)水平最高，因此，選取MHCC97H細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

*P<0.05；**P<0.01。圖1 IncRNA OIP5-AS1在肝癌細(xì)胞系中高表達(dá)Fig.1 IncRNA OIP5-AS1 is highly expressed in HCC cell lines

2.2 IncRNA OIP5-AS1的表達(dá)影響肝癌細(xì)胞EMT 及侵襲遷移能力

qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:在肝癌MHCC97H細(xì)胞中轉(zhuǎn)染sh-lncRNA OIP5-AS1后，lncRNA OIP5-AS1的表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05，圖2a)。結(jié)果顯示:與NC組比較,shOIP5-AS1-1組和shOIP5-AS1-2組肝癌細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白N-cadherin和Vimentin表達(dá)均明顯下調(diào)，同時(shí)E-cadherin 表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05或P<0.01，圖2b和2c)。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:與NC組比較,shOIP5-AS1-1組和shOIP5-AS1-2組肝癌細(xì)胞的侵襲遷移能力也明顯下降(P<0.05，圖2d和2e)。

2.3 LncRNA OIP5-AS1靶向下調(diào)miR-217對(duì)USP7的抑制作用

通過Starbase數(shù)據(jù)庫(kù)檢索預(yù)測(cè)與lncRNA OIP5-AS1可能存在相互作用的miRNA，發(fā)現(xiàn)lncRNA OIP5-AS1與miR-217存在匹配的結(jié)合位點(diǎn)(圖3a)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示:miR-217 mimics 顯著抑制了野生型(WT) lncRNA OIP5-AS1的3′ UTR熒光素酶活性，而對(duì)突變型(MUT) lncRNA OIP5-AS1的3′ UTR熒光素酶活性無影響(P<0.05，圖3b)。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示:敲降lncRNA OIP5-AS1可顯著上調(diào)miR-217的表達(dá)水平(P<0.05，圖3c)。

(a)qRT-PCR分析MHCC97H細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率；(b)和(c)Westernblot分析E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表達(dá)；(d)和(e)Transwell法檢測(cè)MHCC97H細(xì)胞的遷移和侵襲。*P<0.05,**P<0.05。圖2 敲降lncRNA OIP5-AS1抑制MHCC97H細(xì)胞EMT及侵襲遷移Fig.2 Knockdown of lncRNA OIP5-AS1 inhibits the EMT, invasion, and migration of MHCC97H cells

(a)和(d)使用Starbase數(shù)據(jù)庫(kù)分別預(yù)測(cè)lncRNA OIP5-AS1和miR-217，miR-217和USP7的結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)顯示了lncRNA OIP5-AS1和USP7的野生型(WT)和突變型(MUT)3′UTR；(b)和(e)采用雙熒光素酶報(bào)告基因法測(cè)定MHCC97H細(xì)胞的熒光素酶活性；(c)qRT-PCR分析miR-217在MHCC97H細(xì)胞中的表達(dá)；(f)Western blot分析MHCC97H細(xì)胞中USP7的蛋白表達(dá)。*P<0.05。圖3 IncRNA OIP5-AS1靶向下調(diào)miR-217對(duì)USP7的抑制作用Fig.3 IncRNA OIP5-AS1 targeted down-regulates the inhibitory effect of miR-217 on USP7

2.4 MiR-217通過下調(diào)USP7抑制肝癌細(xì)胞的EMT以及侵襲轉(zhuǎn)移

qRT-PCR結(jié)果顯示：在肝癌MHCC97H細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-217 mimics后miR-217表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05，圖4a)。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示：在肝癌MHCC97H細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-217 mimics后，EMT相關(guān)蛋白N-cadherin 和Vimentin表達(dá)均明顯上調(diào)，同時(shí)E-cadherin蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，但共轉(zhuǎn)pcDNA3.1-USP7后USP7和EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖4b、4c)。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：過表達(dá)miR-217可顯著抑制肝癌MHCC97H細(xì)胞的遷移和侵襲能力(P>0.05，圖4d、4e)，但共轉(zhuǎn)pcDNA3.1-USP7 能夠減弱miR-217的抑制作用。

(a)qRT-PCR分析miR-217在MHCC97H細(xì)胞中的表達(dá)；(b)和(c)Western blot分析MHCC97H細(xì)胞中USP7和EMT相關(guān)蛋白的蛋白表達(dá)。(d)和(e)Transwell法檢測(cè)MHCC97H細(xì)胞的遷移和侵襲。*P<0.05。圖4 lncRNA OIP5-AS1/miR-217/USP7分子軸調(diào)控MHCC97H 細(xì)胞EMT及侵襲遷移Fig.4 lncRNA OIP5-AS1/miR-217/USP7 axis regulated EMT, invasion and migration of MHCC97H cells

3 討論

肝癌是世界上最常見的癌癥之一，肝細(xì)胞癌占肝癌病例的絕大多數(shù)[2]。由于肝癌起病隱匿，進(jìn)展迅速，80%的患者喪失了手術(shù)機(jī)會(huì)。雖然姑息性手術(shù)切除、射頻消融術(shù)、經(jīng)動(dòng)脈化療栓塞(TACE)、全身化療、中藥治療可減輕患者癥狀，延緩肝癌進(jìn)展，但這些治療措施并不能明顯提高晚期肝癌患者的生存期，還給患者帶來嚴(yán)重的精神壓力和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[15-18]。而肝癌治療療效達(dá)不到理想效果的關(guān)鍵原因之一在于肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT及侵襲轉(zhuǎn)移[19]。因此，研究肝癌細(xì)胞EMT及侵襲轉(zhuǎn)移的確切分子機(jī)制對(duì)于提高肝癌治療療效是至關(guān)重要的。

研究發(fā)現(xiàn)lncRNAs在不同腫瘤組織中的表達(dá)存在顯著差異[13-14]，關(guān)于這些差異表達(dá)的lncRNAs與腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制之間的關(guān)系的研究也在逐步開展和深化。研究表明：lncRNA OIP5-AS1在肺癌、乳腺癌、多發(fā)性骨髓瘤等腫瘤中高表達(dá)，且可以促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[20-22]。本研究對(duì)lncRNA OIP5-AS1在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)及其在EMT和侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮作用的機(jī)制進(jìn)行了全面的探索。研究中明確了肝癌細(xì)胞中l(wèi)ncRNA OIP5-AS1的表達(dá)均明顯上調(diào)，下調(diào)lncRNA OIP5-AS1的表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞的EMT 及侵襲遷移能力。這表明：lncRNA OIP5-AS1可能參與了肝癌的發(fā)生發(fā)展，且有望成為肝癌治療新的靶點(diǎn)和診斷標(biāo)志物。目前有研究提出lncRNAs作為miRNAs的ceRNAs，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[23]。如研究報(bào)道lncRNA XIST通過充當(dāng)miR-429的分子海綿調(diào)節(jié)ZEB1表達(dá)促進(jìn)胰腺癌發(fā)生發(fā)展[24]；lncRNA-CTS競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-505上調(diào)ZEB2的表達(dá)，促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移和EMT[25]；PTTG3P通過海綿吸附miR-383增加致癌基因CCND1和PARP2的表達(dá)[26]。本研究發(fā)現(xiàn)lncRNA OIP5-AS1與miR-217具有直接靶向關(guān)系，敲降lncRNA OIP5-AS1顯著上調(diào)miR-217在肝癌MHCC97H細(xì)胞中的表達(dá)水平；過表達(dá)miR-217顯著抑制肝癌MHCC97H細(xì)胞的EMT及侵襲遷移過程。這表明lncRNA OIP5-AS1通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-217并調(diào)控其表達(dá)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的EMT及侵襲遷移過程。

利用生物信息學(xué)方法進(jìn)一步預(yù)測(cè)miR-217的潛在下游靶基因。分析表明USP7可能是miR-217的下游靶基因。USP7是一種進(jìn)化保守的蛋白質(zhì)，最初被認(rèn)為是單純皰疹病毒蛋白的分子伴侶，與生長(zhǎng)、發(fā)育和應(yīng)激相關(guān)的幾種細(xì)胞功能密切相關(guān)[27]，如USP7通過去除Axin多聚泛素化修飾從而穩(wěn)定其表達(dá)，并抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路進(jìn)而調(diào)節(jié)Wnt依賴性成骨細(xì)胞分化和脂肪細(xì)胞分化[28]。USP7通過穩(wěn)定Foxp3促進(jìn)調(diào)節(jié)性T(Treg)細(xì)胞的發(fā)育和功能，而敲除Treg細(xì)胞中的USP7則在小鼠中引起致命的全身性自身免疫[29]。USP7在腫瘤發(fā)生中的作用同樣也很重要，文獻(xiàn)[30]報(bào)道USP7在肝癌組織中高表達(dá)并與較差的生存預(yù)后相關(guān)，且可通過去泛素化作用來穩(wěn)定TRIP12，從而使p14(ARF)失活并促進(jìn)肝癌進(jìn)程。過表達(dá)miR-217可顯著下調(diào)USP7的表達(dá)，同時(shí)過表達(dá)USP7可逆轉(zhuǎn)miR-217的抑制作用。結(jié)果表明：lncRNA OIP5-AS1可通過負(fù)性調(diào)控miR-217，上調(diào)USP7的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的EMT和侵襲遷移能力。

綜上所述，lncRNA OIP5-AS1可通過靶向下調(diào)miR-217對(duì)USP7的抑制作用，進(jìn)而影響肝癌細(xì)胞的EMT和侵襲遷移過程。因此，本研究加深了對(duì)肝癌細(xì)胞EMT及侵襲轉(zhuǎn)移的確切分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為肝癌的診斷和治療提供了重要理論依據(jù)。