嚴(yán) 丹 紅 ，姚 驊 珊 ，方 月 琴 ，王 遠(yuǎn) 鵬 ，馬 文 慧 ，李 保 根

（蘇州健雄職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)藥科技學(xué)院，太倉 215411）

骨缺損在臨床上發(fā)病率高，如何修復(fù)大段骨缺損是骨科面臨的挑戰(zhàn)。目前臨床上骨缺損修復(fù)的方法主要有自體骨移植與異體骨移植。[1]由于自體骨移植材料有限，且存在供骨部損傷及塑形困難等一系列問題，而異體骨移植又存在疾病傳播的潛在危險以及排斥反應(yīng)的嚴(yán)重后果，因此兩種方法均無法滿足患者需求。近年來，組織工程技術(shù)的迅速發(fā)展為骨缺損修復(fù)治療帶來新的選擇。[2]現(xiàn)有的骨替代材料采用有機(jī)或無機(jī)材料支架，不能兼具微觀多孔隙結(jié)構(gòu)、良好的生物相容性、可降解性、可控性和力學(xué)性能。因此，開發(fā)具有生物特性且與正常骨相似的復(fù)合支架材料是現(xiàn)在骨組織工程領(lǐng)域研究的重點(diǎn)方向。[3]

BMSCs 因取材方便，具有多向分化潛能、低免疫原性等優(yōu)勢，是組織工程中比較理想的種子細(xì)胞。生長因子是骨組織工程中三大要素之一，可調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的增殖和成骨能力，而BMP-2 是骨生長啟動因子，是已知BMP 家族中具有最強(qiáng)成骨能力的骨生長因子之一。[4]其基因重組產(chǎn)品rhBMP-2（人重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白Ⅱ）于2007 年被美國食品藥品監(jiān)督管理局正式批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床，但rhBMP-2 是小分子物質(zhì)，單純植入后易被血液或組織液稀釋，且很快被蛋白酶降解，半衰期短，不能持續(xù)發(fā)揮其骨誘導(dǎo)作用。[5]此外，作為外源性蛋白植入體內(nèi)，用量大時可能會產(chǎn)生毒性反應(yīng)，還可能引起免疫排斥。研究人員開發(fā)了多種包裹rhBMP-2 的緩釋載體，以用于基礎(chǔ)與臨床治療研究，但或多或少存在一些不足之處。例如聚乳酸、聚乳酸和聚羥基乙酸的共聚物[6-7]等具有骨傳導(dǎo)性及可降解性，作為載體時，大部分rhBMP-2 在植入早期就彌散到組織中，初期降解較快，而且合成的高分子降解物呈酸性，會引起局部酸堿度下降，導(dǎo)致局部組織的無菌性炎癥和異物反應(yīng)，對新骨形成具有抑制作用。I 型膠原的分子結(jié)構(gòu)可以阻止rhBMP-2 迅速彌散流失，但是天然有機(jī)物有不同程度的免疫原性。[8]BMP-2 轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)成骨可實(shí)現(xiàn)一定時間內(nèi)BMP-2 的持續(xù)表達(dá)，能克服上述載體材料的種種不足。已有動物實(shí)驗(yàn)研究表明，BMP-2 基因修飾的犬BMSCs 復(fù)合磷酸鈣骨水泥材料，植入骨缺損模型中能修復(fù)節(jié)段性骨缺損。[9]因此，轉(zhuǎn)基因BMSCs 的應(yīng)用具有廣闊前景。但是BMSCs 的轉(zhuǎn)染時限、過程及效率，轉(zhuǎn)基因BMSCs 的生物學(xué)效應(yīng)，轉(zhuǎn)基因BMSCs 的監(jiān)控手段等，有待于進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)基于基因治療原理，構(gòu)建基因整合慢病毒表達(dá)載體，介導(dǎo)BMP-2 基因誘導(dǎo)入大鼠BMSCs，使BMP-2 在細(xì)胞體內(nèi)連續(xù)穩(wěn)定表達(dá)。之所以選擇慢病毒作為表達(dá)載體，是因?yàn)槁《緦MSCs 的轉(zhuǎn)染效力較高，且不會發(fā)生非特異性細(xì)胞排斥反應(yīng)。此外，慢病毒載體中攜帶綠色熒光蛋白GFP，轉(zhuǎn)染后用倒置熒光顯微鏡觀察GFP 綠色熒光，便于跟蹤、選擇和富集轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

無特定病原體SPF級大鼠10只，體重250 g～280 g，6周～9周齡，由昭衍（蘇州）新藥研究中心提供。實(shí)驗(yàn)過程中對動物的處置符合中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部2006 年頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物的指導(dǎo)性意見》標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 試劑耗材

DMEM（Dulbecco′s Modified Eagle Medium，簡稱DMEM）培養(yǎng)基、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%的胰酶、雙抗、磷酸鹽緩沖液PBS、胎牛血清、總核酸RNA 提取試劑盒、Taq 聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、噻唑藍(lán)MTT（Invitrogen 公司）；反轉(zhuǎn)錄PCR 試劑盒（Takara公司）；兔抗人BMP-2、生物素HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 抗體、辣根過氧化物酶GAPDH標(biāo)記鏈霉親和素HRP 抗體、DAB 辣根過氧化物酶顯色試劑（上海寶生物公司）；細(xì)胞培養(yǎng)瓶、96 孔板（康寧公司）；LV重組載體系列（大鼠BMP-2慢病毒表達(dá)載體）和綠色熒光蛋白GFP（上海吉凱基因化學(xué)有限公司）。

1.3 儀器設(shè)備

生物安全柜（型號BHC-1300IIA-B3，蘇州凈化設(shè)備有限公司）；熒光定量PCR 儀（型號TP800，Takara公司）；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（型號 HERAcell 240i，Thermo 公司）；臺式高速離心機(jī)（型號 5810R，Eppendorf 公司）；熒光倒置顯微鏡（型號YDF-70，Olympus 公司）；酶標(biāo)儀（型號Varioskan LUX，Thermo 公司）。

2 方法和步驟

2.1 大鼠BMSCs 的分離培養(yǎng)

取6 周～9 周齡的體質(zhì)量為250 g～280 g 的大鼠，采用Percoll 細(xì)胞分離液，使用密度梯度離心法和差速貼壁傳代篩選法分離培養(yǎng)大鼠的BMSCs。將大鼠安死術(shù)后，無菌條件下解剖大鼠，分離軟組織，取股端，用培養(yǎng)液沖刷大鼠骨髓，使細(xì)胞分離，制備細(xì)胞懸液。使用離心機(jī)以1 500 r/min速度離心15 min。用3 mL培養(yǎng)液重新懸浮，慢慢加入含有等量Percoll細(xì)胞分離液的離心管中，以2 000 r/min的速度離心30 min。收集界面層細(xì)胞，用DMEM 培養(yǎng)基洗滌2 次，離心后棄上清液，然后加入含胎牛血清（體積分?jǐn)?shù)為10%）的DMEM 培養(yǎng)基，按照4×105個/cm2接種在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，放入CO2體積濃度為5%、溫度為37℃、濕度飽和的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每7天換1次細(xì)胞液，待細(xì)胞貼壁達(dá)到90%時，使用胰酶消化細(xì)胞，再進(jìn)行細(xì)胞傳代。

2.2 慢病毒介導(dǎo)的BMP-2 基因轉(zhuǎn)染

選擇pHBLV-U6-GFP-PGK-Puro 作為質(zhì)粒的克隆載體。BMP-2 慢病毒表達(dá)載體的克隆切入點(diǎn)是XhoI/BamHI。目的基因慢病毒質(zhì)粒構(gòu)建、測序、包裝、濃縮及病毒滴度測定委托上海吉凱基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司進(jìn)行。在轉(zhuǎn)染的前1 d，用胰酶消化細(xì)胞，加入含胎牛血清（體積分?jǐn)?shù)為10%）的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞密度為 6×106個/mL～ 8×106個/mL。[10]將狀態(tài)良好的第三代 BMSCs 鋪于 6 孔板，細(xì)胞量為每孔 5×105個細(xì)胞，37℃培養(yǎng)過夜。第二天待細(xì)胞貼壁后，將慢病毒原液解凍，測定病毒滴度為5×108TU/mL，MoI（Multiplicity of Infection，感染復(fù)數(shù)）為20，將含有20 μL 病毒液的培養(yǎng)液輕輕滴加在細(xì)胞上并混勻。將培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培育。第二天用新鮮的完全培養(yǎng)液取代含有病毒的舊液，再將培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)進(jìn)行培育。待到第五天取出培養(yǎng)皿，用熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞熒光表達(dá)情況。

2.3 細(xì)胞BMP-2 mRNA 表達(dá)水平

用總RNA 提取試劑盒Trizol 提取相對穩(wěn)定并已經(jīng)轉(zhuǎn)染的大鼠BMSCs 總RNA，以總RNA 為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，具體操作參照說明書。反轉(zhuǎn)錄后以BMP-2 引物對其進(jìn)行擴(kuò)增。取無菌PCR 管，管內(nèi)依次加入反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 2 μL、上游引物 2 μL、下游引物 2 μL、PCR 緩沖液 5 μL、Taq 聚合酶 1 μL，補(bǔ)足去離子水使總體積為50 μL。反應(yīng)條件為 95°C 下 30 s，54°C 下 40 s，72°C 下 30 s，進(jìn)行 30 個循環(huán)。以 1.2% 瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。反應(yīng)中以肌動蛋白β-actin 為內(nèi)參照物，與未經(jīng)轉(zhuǎn)染的大鼠BMSCs 作為陰性對照[11]，檢測樣品中mRNA相對表達(dá)量。BMP-2（F）：5’-AATTCTGGGAGGGCTTGGTT-3’，（R）5’-CTGTTTCAGGCCGAACATGC-3；β-actin（F）：5’-GTTGACATCCGTAAAGAC-3’（R）5’-GGACAGTGAGGCCAGGATA-3’。

2.4 蛋白質(zhì)印跡分析BMP-2 的胞內(nèi)表達(dá)

將穩(wěn)定已轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染的BMSCs 以1×105個/cm2密度接種在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，等細(xì)胞生長至90%融合度時，用胰酶消化細(xì)胞，在收集的細(xì)胞中加入細(xì)胞裂解液，于4℃裂解細(xì)胞，以12 000 r/min 的速度離心15 min，上清液即為蛋白提取液。用質(zhì)量濃度為15%的SDS-PAGE（蛋白質(zhì)變性劑聚丙烯酰胺凝膠電泳）分離蛋白質(zhì)，使用80 V 電壓、120 min 轉(zhuǎn)印至PVDF（聚偏二氟乙烯）膜，依次以兔抗人BMP-2、HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG進(jìn)行雜交，然后用DAB 顯色并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2.5 ELISA 檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中目的蛋白含量

將持續(xù)轉(zhuǎn)染的BMSCs 和未轉(zhuǎn)染的BMSCs 培養(yǎng)上清液，采取雙抗體夾心法檢測其中目標(biāo)蛋白的表達(dá)。以兔抗人BMP-2 抗體包被96 孔板，依次加入細(xì)胞培養(yǎng)上清液、兔抗人BMP-2 抗體、HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG、GAPDH 標(biāo)記的HRP，DAB 顯色。用酶標(biāo)儀讀取460 nm 處的吸光度。

配制 500 ng/mL 標(biāo)準(zhǔn) BMP-2 蛋白稀釋液，倍比稀釋成 250 ng/mL、125 ng/mL、62.5 ng/mL、31.25 ng/mL、15.63 ng/mL、7.813 ng/mL、3.906 ng/mL，測定各稀釋樣品在460 nm 處的吸光度，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.6 MTT 法 檢 測 BMSCs 增 殖 能 力

以空載體BMSCs 和未轉(zhuǎn)染BMSCs 作為實(shí)驗(yàn)對照，檢測轉(zhuǎn)染后第三代BMSCs 的增殖能力。將細(xì)胞以2×103個/mL 的密度接種于5塊96孔板中。細(xì)胞貼壁后，采用MTT 法檢測BMSCs 增殖能力。培養(yǎng)至預(yù)定天數(shù)，檢測時每孔加入5 mg/mL 的MTT 染液20 μL，在培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去孔內(nèi)的培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜150 μL 溶解結(jié)晶。振蕩器振蕩10 min，搖勻，用酶標(biāo)儀讀取每孔490 nm 處的吸光度。

2.7 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，結(jié)果采用單因素方差分析（當(dāng)P＜0.05 時，判定分析結(jié)果具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異）。所有檢驗(yàn)在SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件上完成。

3 結(jié)果與分析

3.1 大鼠BMSCs 的形態(tài)觀察

原代培養(yǎng)的BMSCs 接種24 h 后開始貼壁，貼壁細(xì)胞有偽足伸出，呈現(xiàn)多個細(xì)胞聚集樣。培養(yǎng)至第三代時，細(xì)胞為長梭形成纖維細(xì)胞，完全融合后呈漩渦狀或者輻射狀生長，細(xì)胞增殖迅速，如圖1 所示。

圖1 BMSCs 培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)照片（×200）

3.2 慢病毒介導(dǎo)的BMP-2 基因轉(zhuǎn)染結(jié)果

細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后熒光顯微鏡照片見圖2，細(xì)胞轉(zhuǎn)染前無綠色熒光，慢病毒介導(dǎo)的BMP-2基因轉(zhuǎn)染BMSCs后在熒光顯微鏡下顯示綠色熒光，表明BMSCs 被成功轉(zhuǎn)染。誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞形態(tài)變化與預(yù)期相符。

圖2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后熒光顯微鏡照片

3.3 BMP-2 mRNA 表達(dá)水平

BMP-2 mRNA 表達(dá)水平檢測結(jié)果見圖3。RT-PCR 結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染細(xì)胞的BMP-2 mRNA 表達(dá)水平明顯高于未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。BMP-2 mRNA 的相對表達(dá)量兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 BMP-2 mRNA 相對表達(dá)量

3.4 蛋白質(zhì)印跡分析BMP-2 的胞內(nèi)表達(dá)

蛋白印跡結(jié)果如圖4 所示，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞以兔抗人BMP-2 抗體、GAPDH 標(biāo)記的羊抗兔IgG 抗體進(jìn)行雜交。在轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解液中檢測出帶狀物，與預(yù)期的效果一致。反觀在未轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解液中只有GAPDH 條帶，沒有檢測出目的基因BMP-2 條帶。

圖4 BMP-2 蛋白表達(dá)

3.5 ELISA 檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中目的蛋白的質(zhì)量濃度

用酶標(biāo)儀讀取每孔的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖5）計(jì)算細(xì)胞培養(yǎng)上清液中BMP-2 目的蛋白的質(zhì)量濃度，結(jié)果如圖6 所示，轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中BMP-2 的質(zhì)量濃度明顯高于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的（P＜0.05）。

圖5 標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖6 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中BMP-2目的蛋白的質(zhì)量濃度

3.6 MTT 法 測 定 BMSCs 增 殖 能 力

活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT 還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜能溶解細(xì)胞中的甲臜，用酶標(biāo)儀測定490 nm 處的吸光度，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT 結(jié)晶形成量與細(xì)胞數(shù)成正比。由圖7 可見，與未轉(zhuǎn)染的BMSCs、空載體BMSCs相比，轉(zhuǎn)染BMSCs 增殖速度顯著高（P＜0.05）。

圖7 MTT 法測定的BMSCs 增殖結(jié)果

4 討論

雖然BMSCs 易獲得，但它在骨髓中含量較低，因此科研人員往往需要對BMSCs 在體外進(jìn)行分離、純化和大規(guī)模擴(kuò)增以獲得大量高純度的BMSCs 來滿足實(shí)際應(yīng)用需要。目前，國內(nèi)外常用的分離方法有貼壁篩選分離法、密度梯度離心法、細(xì)胞表面分子標(biāo)記分選法。本實(shí)驗(yàn)中先用密度梯度離心法分離BMSCs，再采用貼壁篩選分離法對細(xì)胞進(jìn)行純化，此方法操作簡便，可獲得大量性能穩(wěn)定的BMSCs。

通過基因工程技術(shù)治療骨缺損相比傳統(tǒng)手段具有較大的優(yōu)勢。慢病毒載體介導(dǎo)的基因治療技術(shù)不僅可以高效、持續(xù)、可控地于局部釋放高生物活性的成骨類生長因子，還可以從根本上解決外源性生物蛋白成骨作用弱、價格高、降解速度快等問題。BMP-2 是骨缺損修復(fù)領(lǐng)域研究最多、最深入的成骨生長因子。本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了含BMP-2 基因的重組慢病毒表達(dá)載體，倒置熒光顯微鏡下觀察到轉(zhuǎn)染BMSCs 顯示綠色熒光，轉(zhuǎn)染BMSCs 的BMP-2 mRNA 表達(dá)水平明顯高于未轉(zhuǎn)染BMSCs 的，轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解液中檢測出BMP-2 條帶，轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清液中BMP-2蛋白質(zhì)量濃度明顯高于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的BMP-2蛋白質(zhì)量濃度。MTT 法的測定結(jié)果顯示，BMP-2基因轉(zhuǎn)染的BMSCs 增殖速度顯著高于空載體細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞（P＜0.05）。