雷志恒 王壯壯 龔 偉 劉彥廷

(三峽大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院[宜昌市中心人民醫(yī)院] 神經(jīng)外科， 湖北 宜昌 443003)

腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，惡性程度較高，多呈侵襲式生長，綜合治療后極易復(fù)發(fā)。既往研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長因子β受體1(transforming growth factor beta type I receptor, TGFBR1)在膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲中發(fā)揮重要調(diào)控作用[1]。Huynh等[2]提出，抑制TGFBR1活性可降低膠質(zhì)瘤侵襲能力。然而，TGFBR1拮抗劑如曲尼司特或SD-208缺乏敏感性及靶向性[2]，臨床應(yīng)用受限。因此，尋找新的調(diào)控因子對腦膠質(zhì)瘤治療具有重要臨床意義。

前期研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤細(xì)胞染色體9q22.33出現(xiàn)局部缺失或突變的幾率約為18%，而lncRNA NAMA(long non-protein coding RNA，associated with MAP kinase pathway and growth arrest，NAMA)與該位點高度重合，且位于TGFBR1上游[3]。替莫唑胺(temozolomide, TMZ)耐藥膠質(zhì)瘤細(xì)胞中l(wèi)ncRNA NAMA表達量高于TMZ敏感細(xì)胞[4]。Zheng等[5]在甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)，lncRNA NAMA對細(xì)胞增殖、凋亡、DNA損傷、細(xì)胞周期、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信號通路等發(fā)揮調(diào)控作用。鑒于多數(shù)lncRNAs可作為順/反式作用元件調(diào)控臨近基因轉(zhuǎn)錄，本研究擬探討lncRNA NAMA對膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲能力的影響，并探索其作用機制，以期為膠質(zhì)瘤治療提供新的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 膠質(zhì)瘤組織及細(xì)胞

本研究選取2018年6月～2020年1月在我院接受手術(shù)治療的膠質(zhì)瘤患者組織樣本共30例，經(jīng)患者知情同意(倫理批準(zhǔn)編號：HEC-KYJJ2018-006-01)。納入標(biāo)準(zhǔn)：參考世界衛(wèi)生組織(World Health Organization, WHO)膠質(zhì)瘤診斷及分級標(biāo)準(zhǔn)，術(shù)后病理診斷為膠質(zhì)瘤。入選患者術(shù)前未接受抗腫瘤治療。膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87購自南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實驗室。

1.2 主要試劑及設(shè)備

RT-PCR試劑盒購于日本TaKaRa公司，CCK-8試劑盒購于美國Sigma公司，TGFBR1和β-actin抗體均購于Abcam公司，transwell試劑盒購自武漢賽維爾科技有限公司，lncRNA NAMA過表達質(zhì)粒(plasmid complementory DNA-NAMA，pcDNA-NAMA)及對照(pcDNA vacancy control，pcDNA-VC)、lncRNA NAMA干擾質(zhì)粒(small interference-NAMA，si-NAMA)及對照(si-negative control, si-NC)、TGFBR1干擾質(zhì)粒(small interference-TGFBR1，si-TGFBR1)及對照(si-NC)由上?？党缮锕竞铣?，胎牛血清購自美國Gibco公司，RPMI 1640購自廣州益龍科技有限公司，Lipofectamine 2000及TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司。

1.3 膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87培養(yǎng)及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

U87細(xì)胞置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)，添加鏈霉素100 μg/mL及青鏈霉100 μg/mL，設(shè)定培養(yǎng)箱參數(shù)：恒溫37℃、95%飽和濕度，5% CO2培養(yǎng)箱，視細(xì)胞生長狀態(tài)2～3天更換培養(yǎng)基。使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染細(xì)胞至融合，Opti-MEM稀釋pcDNA或siRNA，靜置待RNA/DNA-Lipofectamine 2000混合，15 min后加入細(xì)胞培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。

1.4 實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)

采用TRIzol試劑提取細(xì)胞或組織總RNA，按照RT-PCR試劑盒說明書合成cDNA。采用ABI Prism 7500型熒光定量PCR儀進行擴增，選擇內(nèi)參GAPDH進行標(biāo)準(zhǔn)化，采用2-△△Ct法計算基因的相對表達量。

NAMA上游引物序列：5’-ATCCGCCCGTTACTAAACG-3’；下游引物序列：5’-CCGTCTAG-AGCAGGCCCACCTA-3’。

TGFBR1上游引物序列：5’-ATGTGCCTGCACGGCCATAG-3’；下游引物序列：5’-ACCGGTATCGTTCCGTTGATGC-3’。

GAPDH上游引物序列：5’-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3’；下游引物序列：5’-CAAAGTTGTCATGGATGHACC-3’。

1.5 Transwell檢測細(xì)胞侵襲

在24孔板中插入帶基質(zhì)膠預(yù)涂層的transwell腔體，取200 μL細(xì)胞懸液接種于包被基質(zhì)膠的上室，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×104個/mL，下室含完全培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，取出腔室，4%多聚甲醛固定20 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min。每個樣品隨機選取6個視野，統(tǒng)計穿透細(xì)胞數(shù)量。

1.6 Western blot檢測TGFBR1蛋白表達

取對數(shù)生長期細(xì)胞，提取總蛋白后行10%SDS-PAGE凝膠電泳分離目標(biāo)蛋白。將目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)膜后，封閉2 h，4℃下加入TGFBR1(1∶1 000)、β-actin(1∶1 000)抗體4℃孵育24 h，洗膜3次后滴加二抗(1∶2 000)，室溫下孵育1.5～2 h。滴加化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)反應(yīng)2 min，使用ChemiDocMP顯影。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA NAMA在膠質(zhì)瘤組織中的表達情況

UCSC數(shù)據(jù)庫顯示：lncRNA NAMA位于第9號染色體，NC_000009.12(99355340..99375257)，TGFBR1基因下游，基因全長1 681 nt，相關(guān)外顯子10個。在30例膠質(zhì)瘤組織中，lncRNA NAMA表達量與患者年齡、性別無相關(guān)性(均P>0.05)，與膠質(zhì)瘤病理分級存在正相關(guān)性(P>0.05，見表1)。

表1 lncRNA NAMA表達量與膠質(zhì)瘤患者臨床特征關(guān)系

RT-PCR結(jié)果顯示：lncRNA NAMA在腫瘤組織中表達量高于瘤旁組織(t=4.59，P<0.01)，詳見圖1。

注：膠質(zhì)瘤組織與瘤旁組織比較，*P<0.01圖1 RT-PCR檢測lncRNA NAMA在不同組織中的表達量

2.2 lncRNA NAMA對U87細(xì)胞侵襲能力的影響

lncRNA NAMA過表達質(zhì)粒(pcDNA-NAMA)或干擾質(zhì)粒(si-NAMA)轉(zhuǎn)染U87細(xì)胞后，RT-PCR檢測結(jié)果顯示，pcDNA-NAMA組NAMA含量高于pcDNA-VC組(t=5.31,P<0.01)(圖2A)；si-NAMA組NAMA含量低于si-NC組(t=4.36,P<0.01)(圖2B)。Transwell結(jié)果顯示，pcDNA-NAMA組視野內(nèi)透過細(xì)胞數(shù)多于pcDNA-VC組(226±27.30 vs 156±18.41，t=3.68，P<0.01)，si-NAMA組視野內(nèi)透過細(xì)胞數(shù)少于si-NC組(84±9.63 vs 142±15.22，t=3.72,P<0.01)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(圖2C)。

注：A、B：lncRNA NAMA的相對表達量，與對照組相比，*P<0.01；C：Transwell法檢測細(xì)胞穿透數(shù)量，結(jié)晶紫染色(×200)圖2 lncRNA NAMA對U87細(xì)胞侵襲能力的影響

2.3 lncRNA NAMA對TGFBR1表達的影響

RT-PCR及Western blot結(jié)果顯示，pcDNA-NAMA組細(xì)胞TGFBR1的mRNA及蛋白含量均高于pcDNA-VC組(圖3A、3C)(均P<0.01)；si-NAMA組細(xì)胞TGFBR1的mRNA及蛋白含量均低于si-NC組(圖3B、3C)(均P<0.01)。

注：A、B：RT-PCR檢測lncRNA NAMA的相對表達量，與對照組相比，*P<0.01；C：Western blotting檢測各組細(xì)胞TGFBR1蛋白表達情況圖3 lncRNA NAMA對TGFBR1表達的影響

2.4 下調(diào)TGFBR1對lncRNA NAMA調(diào)控U87細(xì)胞侵襲的影響

為驗證lncRNA NAMA調(diào)節(jié)U87細(xì)胞侵襲是否依賴TGFBR1，將si-TGFBR1與pcDNA-NAMA質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染U87細(xì)胞。Transwell檢測結(jié)果顯示，si-TGFBR1+pcDNA-VC組與si-TGFBR1+pcDNA-NAMA組相比，視野內(nèi)透過細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(77±9.34 vs 86±8.52，t=0.43,P>0.05，見圖4)。

注：Transwell法檢測細(xì)胞穿透數(shù)量，結(jié)晶紫染色(×200)圖4 下調(diào)TGFBR1對lncRNA NAMA調(diào)控U87細(xì)胞侵襲的影響

3 討論

Cunha等[6]通過蛋白質(zhì)譜分析膠質(zhì)瘤患者的病理組織，發(fā)現(xiàn)侵襲相關(guān)蛋白含量較高的患者群體復(fù)發(fā)率更高，生存周期更短，更易出現(xiàn)化療耐藥。在膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲的機制研究中，TGFBR1發(fā)揮重要調(diào)控作用。如Zhang等[7]研究顯示，通過抑制TGFBR1活性，可提高膠質(zhì)瘤患者放化療敏感性，并延長膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者生存周期。Liu等[8]在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中敲除TGFBR1后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖活性明顯降低。然而，由于TGFBR1的反義寡核苷酸或蛋白酶抑制劑缺乏靶向性及特異性，這限制了TGFBR1在膠質(zhì)瘤生物治療中的進展。因此，探索新的調(diào)控因子具有重要的臨床指導(dǎo)意義。

近期研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞系中存在異常表達的lncRNAs，對膠質(zhì)瘤的侵襲能力發(fā)揮重要調(diào)控作用。Li等[9]發(fā)現(xiàn)，lncRNA-ZNF281通過影響膠質(zhì)瘤干細(xì)胞活性，調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251的增殖與侵襲。Dai等[10]發(fā)現(xiàn)，lncRNA AWPPH 通過激活TGF-β信號通路，促進膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲與遷移。本研究結(jié)果顯示，lncRNA NAMA在不同病理級別膠質(zhì)瘤組織中，存在差異性表達。在Ⅲ+Ⅳ級膠質(zhì)瘤組織中，表達量高于Ⅰ+Ⅱ級。此外，過表達lncRNA NAMA后，細(xì)胞侵襲能力增強，抑制其表達后，細(xì)胞侵襲能力降低，提示lncRNA NAMA參與調(diào)控U87細(xì)胞的侵襲。

目前關(guān)于lncRNA NAMA的研究主要集中在細(xì)胞增殖、凋亡、DNA損傷、細(xì)胞周期及MAPK信號通路等方面[11]。Zheng等[5]通過小干擾RNA(siRNA)技術(shù)敲除甲狀腺癌K1細(xì)胞中的NAMA后，細(xì)胞凋亡比例增高，細(xì)胞生長停滯。MEK抑制劑或依托泊苷處理NPA87細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)ERK磷酸化水平降低，細(xì)胞生長速度減慢。本研究通過對lncRNA NAMA和TGFBR1染色質(zhì)位點分析發(fā)現(xiàn)，lncRNA NAMA與TGFBR1均位于第9號染色體，lncRNA NAMA基因全長1 681 nt，位于TGFBR1基因下游。在U87細(xì)胞中，lncRNA NAMA過表達或抑制后，TGFBR1 mRNA和蛋白質(zhì)水平均相應(yīng)升高或者降低，提示lncRNA NAMA可能是TGFBR1的調(diào)控因子之一。

LncRNA對編碼基因的調(diào)控方式較多，包括lncRNA轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，蛋白質(zhì)修飾與錨定及編碼功能性微肽等。在mRNA選擇性剪接過程中，Booy等[12]發(fā)現(xiàn)，lncRNA BC200通過剪接因子hnRNP A2/B1，與Bcl-x前體mRNA形成復(fù)合體，參與調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的遷移。此外，lncRNAs可形成保護性“l(fā)ncRNA-mRNA”雙鏈結(jié)構(gòu)，增強mRNAs穩(wěn)定性。Sheng等[13]在膠質(zhì)瘤組織中發(fā)現(xiàn)，lncRNA ST7-AS1可靶向結(jié)合PTBP1 mRNA前體，抑制其降解。除調(diào)控mRNA選擇性剪接及穩(wěn)定性外，競爭性結(jié)合內(nèi)源性RNA(ceRNAs)或miRNA海綿機制同樣參與lncRNAs轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[14]。Zheng等[15]在高級別膠質(zhì)瘤母細(xì)胞瘤患者中證實，lncRNA CRNDE競爭性結(jié)合miR-384，降低miR-384對其下游靶基因STAT3、cyclin D1和Bcl-2的抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)，在U87細(xì)胞中干擾或過表達NAMA后，TGFBR1 mRNA及蛋白含量均相應(yīng)降低或升高。基于lncRNA NAMA與TGFBR1染色質(zhì)位置臨近，推測其可能通過與TGFBR1 RNA結(jié)合，或增強TGFBR1轉(zhuǎn)錄等方式發(fā)揮作用。同時，不排除lncRNA作為宿主RNA，通過形成siRNA或miRNA片段發(fā)揮作用，課題組后期將深入對比NAMA保守區(qū)域序列與TGFBR1關(guān)聯(lián)miRNA序列，進一步探索NAMA對TGFBR1的調(diào)控機制。

本研究不足之處在于未將lncRNA NAMA與TGFBR1激動劑或抑制劑進行對比，且所選細(xì)胞系較為單一，并未在動物實驗中加以論證，后期我們將進一步探索，以期為膠質(zhì)瘤治療提供新的實驗依據(jù)。