付 祥， 劉曉娜， 劉瑞雪， 蘇建青， 褚秀玲

（聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東聊城 252000）

長期使用抗生素所帶來的食品安全問題、生態(tài)環(huán)境問題等正在顯現(xiàn)（尹珺伊等，2021）。根據(jù)中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第194 號公告的要求（中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部，2019），全面停止生產(chǎn)和使用除中藥外的所有促進生長類的藥物飼料添加劑。 因此，選擇一種綠色、健康的飼料添加劑是現(xiàn)在畜牧業(yè)的重點方向。

乳酸菌是目前益生菌研究和應(yīng)用的重點對象之一，研究認為，乳酸菌作為畜禽腸道內(nèi)重要的一種益生菌，不僅直接影響畜禽的健康和生長，還對畜禽的自身免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)發(fā)展起到重要的協(xié)助保護作用（王天威等，2020）；其通過產(chǎn)乳酸菌素以及多種有機酸來改善機體腸道菌群 （Wu 等，2019；匡珍等，2019）； 通過產(chǎn)酸以及附著于宿主腸道細胞的方式， 來抑制抑制動物消化道中諸如沙門氏菌、 大腸桿菌、 葡萄球菌等有害菌群的定植（Yousef Nami 等，2018；Nejati 等，2016；謝璐娜等，2016）； 還可以降低炎癥反應(yīng) （Shilan Wang 等，2019）以及清除氧自由基，抑制細胞產(chǎn)生活性氧，發(fā)揮其抗氧化（賀騰飛等，2019）的作用。 因此，篩選出具有良好性能的乳酸菌菌株具有重要意義（王文梅等，2013）。

本試驗以烏雞腸道微生物菌群為試驗研究的樣本， 使用腸道微生物的試驗方法 （何江波等，2021），從健康烏雞的腸道中，篩選出性能良好的乳酸菌（劉小蘭等，2020），并研究所選菌株N 的生物學(xué)特性以及抑菌性能（張磊等，2021），為分離的乳酸菌菌株N 應(yīng)用于微生態(tài)制劑以及飼料添加劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器 烏雞糞便來自30 周齡的健康烏雞。試驗所需液體以及固體培養(yǎng)基、革蘭氏染色以及生化試驗所需試劑均購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。 病原菌由聊城大學(xué)實驗室分離保存。 藥敏片購自杭州微生物試劑有限公司；PCR 相關(guān)試驗用品購自上海生工生物工程股份有限公司。

UV-5900 紫外可見分光光度計， 上海元析儀器有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；瓊脂糖凝膠電泳儀，北京市六一生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品處理 健康烏雞的糞便用無菌生理鹽水稀釋后， 使用滅菌紗布過濾除去烏雞腸道中的剩余內(nèi)容物（楊逢清等，2020）。使用無菌生理鹽水稀釋濾液，按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7依次進行梯度稀釋，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 分離純化 使用一次性注射器抽取稀釋的糞便濾液，將其加入滅菌完畢的MRS 肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃增菌培養(yǎng)24 h， 增菌完成后將菌液梯度稀釋至10-7，移液器吸取梯度稀釋至10-5～10-7的菌液各100 μL， 均勻涂布在加入了2%碳酸鈣的選擇培養(yǎng)基上（尹樂斌等，2016），平板在37 ℃培養(yǎng)24 h。 用接種環(huán)在選擇培養(yǎng)基上挑取含有溶鈣圈的單菌落，使用平板劃線法在MRS 瓊脂培養(yǎng)基上進行劃線純化， 直至出現(xiàn)革蘭氏染色為陽性的菌株。 從平板中挑取單個菌落， 將單株細菌純化增菌培養(yǎng)，用體積分數(shù)50%甘油保存純化增菌后的菌株，并將其放于-80 ℃超低溫冰箱中，以上工作均在超凈工作臺中進行。

1.2.3 革蘭氏染色和生化鑒定 用接種環(huán)取單菌落涂布于滴加生理鹽水的干凈載玻片上， 通過革蘭氏染色進行初步鑒定； 染色完畢后對菌株形態(tài)特征進行觀察記錄； 用接種環(huán)蘸取一環(huán)菌液涂于干凈載玻片上，進行過氧化氫酶試驗，無氣泡產(chǎn)生則為陰性； 再進行10 種糖醇類發(fā)酵產(chǎn)酸試驗，進行進一步的驗證。

1.2.4 16S rDNA 鑒定 用煮沸法提取純化后菌株N 的基因組DNA，使用細菌16S rDNA 通用引物27F 和1492R 擴增目的基因片段 （上游引物：27F：5'-AGAGTTTGATCATGGCTGAG-3； 下游引物1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）。以基因組DNA 為模板， 進行菌株N 的16S rDNA PCR 擴增。PCR 反應(yīng)體系（25 μL）：Premix 13 μL，ddH2O 8 μL，上下游引物各1.0 μL，DNA 2 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s；54 ℃退火45 s；72 ℃延伸1 min，35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。 PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像分析儀觀察結(jié)果。

將純化的菌株， 挑選出平板劃線法單菌落多的一次性平皿，送往青島測序公司進行測序，將菌株N 的測序結(jié)果在NCBI 網(wǎng)站上進行同源性比較。下載同源性最高的模式菌株核苷酸序列，利用MEGA 7.0 軟件構(gòu)建菌株N 的系統(tǒng)進化樹。

1.2.5 生物學(xué)特性研究

1.2.5.1 菌株生長曲線測定 取菌株24 h 發(fā)酵液，以2%接種量接種MRS 肉湯，37 ℃培養(yǎng)。 間隔2 h 取樣一次，使用滅菌MRS 肉湯為空白對照，在波長600 nm 處檢測菌株N 發(fā)酵液OD600nm值。 以培養(yǎng)時間為橫坐標， 測定的OD600nm值為縱坐標，制作菌株N 的生長曲線圖。

1.2.5.2 菌株產(chǎn)酸曲線測定 取菌株N 的24 h發(fā)酵液，按照2%接種量，將其接種至滅菌MRS 肉湯，37 ℃培養(yǎng)。 每隔6 h 取樣，測定不同培養(yǎng)時間菌株發(fā)酵液pH。以培養(yǎng)時間為橫坐標，測定的pH為縱坐標，制作菌株N 的產(chǎn)酸曲線圖。

1.2.5.3 菌株的耐酸、 耐膽堿能力 配制pH 為2.0、3.0、4.0、5.0 和6.0 的MRS 肉 湯 培 養(yǎng) 基，在121.6 ℃條件下滅菌15 min。 取菌株N 的24 h 發(fā)酵液，以2%接種量接種MRS 肉湯，于37 ℃培養(yǎng)24 h， 使用無菌MRS 肉湯為空白對照。 在波長OD600nm處取樣， 測定培養(yǎng)基pH 不同時菌株N 發(fā)酵液的OD600nm值。 以pH 為橫坐標，OD600nm值為縱坐標，制作菌株N 的耐酸能力曲線圖。

配制濃度條件為0.10%、0.15%、0.20%、0.25%和0.30%的牛膽酸鈉， 將其順序加入至MRS 肉湯培養(yǎng)基中，在121.6 ℃條件下滅菌15 min。 取菌株N 的24 h 發(fā)酵液，以2%接種量接種，于37 ℃培養(yǎng)24 h，使用無菌MRS 肉湯為空白對照。于波長600 nm 處測定膽鹽濃度不同時菌株發(fā)酵液的OD600nm值。以膽鹽濃度為橫坐標，OD600nm值為縱坐標，制作菌株N 的耐膽堿能力曲線圖。

1.2.6 抑菌試驗 將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌分別接種于普通肉湯培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h； 將菌株N 按照2%接種量接種至MRS 肉湯當中，37 ℃培養(yǎng)24 h，調(diào)節(jié)發(fā)酵液菌體濃度為1×108cfu/mL。取致病菌的菌液100 μL 均勻涂布于麥康凱以及營養(yǎng)瓊脂平板上，滴加50 μL 菌株N 的菌液，4 ℃放置12 h 后，將以上平板放于37 ℃培養(yǎng)24 h，測量菌株N 對病原菌的抑菌圈直徑。

1.2.7 藥敏試驗 試驗測定分離菌株N 的藥物敏感性，將菌株N 按照2%接種量接種至MRS 肉湯當中，37 ℃培養(yǎng)24 h。 均勻涂布100 μL 菌株N的菌液于MRS 瓊脂培養(yǎng)基上，用無菌鑷子夾取藥敏片，將其放置于培養(yǎng)基表面壓緊，將培養(yǎng)基置于37 ℃培養(yǎng)24 h，根據(jù)產(chǎn)生的抑菌圈大小評定菌株N 的藥物敏感性（李肖等，2017）。

2 結(jié)果

2.1 菌落形態(tài)及鏡檢結(jié)果 培養(yǎng)24 h，觀察到菌株N 的菌落凸起，白色，邊緣整齊（圖1）；在MRS 培養(yǎng)基中加入2%碳酸鈣， 菌株N 菌落周圍產(chǎn)生融鈣圈（圖2）；對菌株N 染色后進行鏡檢，結(jié)果如圖3 所示， 菌株N 的形態(tài)呈現(xiàn)桿菌， 兩端圓， 成短鏈。

圖1 分離菌菌落形態(tài)

圖2 分離菌產(chǎn)生的融鈣圈

圖3 分離菌染色鏡檢圖

2.2 生化鑒定結(jié)果 由表1 可知， 菌株N 生化鑒定結(jié)果與乳桿菌基本相符。

表1 菌株N 生化鑒定結(jié)果

2.3 16S rDNA 鑒定結(jié)果 通過煮沸法提取菌株N 的基因組DNA，對菌株N 進行PCR 擴增，得到片段約為1500 bp 的特異性條帶（圖4），與預(yù)計得到的條帶大小相符。 測序后得到的菌株N 序列在NCBI 比對結(jié)果顯示，菌株N 和戊糖乳桿菌的相似度達100%。 利用MEGA 7.0 軟件繪制得系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5）。

圖4 分離菌電泳結(jié)果

圖5 菌株N 的16S rDNA 基因系統(tǒng)發(fā)育進化樹

2.4 生物學(xué)特性研究

2.4.1 生長曲線以及產(chǎn)酸試驗結(jié)果 由圖6 可見，0 ～6 h 菌株N 處于遲緩期，6 ～18 h 菌株N 處于對數(shù)期，18 h 后趨于穩(wěn)定。 菌株N 能夠較快到達對數(shù)期，生長特性良好。由圖7 可見，0 ～6 h 菌株N 發(fā)酵液的pH 下降較慢，6 ～18 h 菌株N 發(fā)酵液的pH下降速度較快，18 h 后pH 趨于穩(wěn)定。 數(shù)據(jù)顯示，菌株N 菌液的pH 下降幅度符合菌株生長曲線增幅，pH 降低25%。結(jié)果表明菌株N 在增殖過程中產(chǎn)酸，其可通過降低發(fā)酵液的pH 來抑制雜菌生長。

圖6 乳酸菌N 生長曲線圖

圖7 乳酸菌N 產(chǎn)酸曲線

2.4.2 不同pH 條件對菌株N 存活數(shù)的影響 由圖8 可見，pH 為6 時，菌株N 的OD600nm值為3，隨著MRS 肉湯pH 的減小，其OD600nm值逐漸降低，在pH 為2 ～3 時，菌株N 的OD600nm值較小，說明菌株N 具有一定的耐酸性。

圖8 乳酸菌N 在不同pH 下的OD 值

2.4.3 不同膽鹽條件對菌株N 存活數(shù)的影響由圖9 可見，膽鹽均能抑制菌株N 的生長，菌株N 的OD600nm值與膽鹽濃度呈相反的趨勢，即菌株N 的OD600nm值隨著膽鹽濃度的不斷升高而下降，但是菌株N 在高濃度的膽鹽中，OD 值仍在2 以上，表明其仍然有較高的活性，因此菌株N 具有一定的耐膽鹽特性。

圖9 乳酸菌N 在不同濃度膽鹽下的OD 值

2.4.4 抑菌試驗結(jié)果 由圖10、圖11 可知，菌株N 對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌兩種病原菌均有良好抑菌性，抑菌圈直徑分別約為35、30 mm。

圖10 乳酸菌N 對金黃色葡萄球菌的抑菌效果

圖11 乳酸菌N 對大腸桿菌的抑菌效果

2.4.5 藥敏試驗結(jié)果 根據(jù)微生物敏感性執(zhí)行標準對藥物敏感性進行區(qū)分， 并將藥物敏感性分為敏感（S）、中介（I）、耐藥（R）。 由表2 可知，菌株N對乙酰螺旋霉素等高度敏感，對環(huán)丙沙星等耐藥。

表2 分離菌藥敏試驗結(jié)果

3 討論

作為動物腸道中常見的細菌， 乳酸菌與動物機體的健康有著密切的聯(lián)系 （Pokorná Alexandra等，2019）。 乳酸菌作為一種益生菌具有提高飼料利用率（秦紅等，2017）、改善動物消化道功能（張彩鳳等，2017）、促進機體發(fā)育（周凌博等，2019）、提高免疫力（孔雨昕等，2021）等益生功能。在畜牧生產(chǎn)中， 用來制作飼料添加劑以及微生態(tài)制劑的菌株主要從動物和人類的消化道、 土壤以及發(fā)酵食物中分離， 而不同動物體內(nèi)的乳酸菌對于腸道的黏附力也不相同（Paula Carasi 等，2013），因此篩選出抗逆性好的同源乳酸菌菌株， 對于畜牧業(yè)具有重要的意義。

乳酸菌發(fā)揮其益生作用的前提是能夠定植于家畜腸道，并能夠大量增殖，其通過產(chǎn)生有機酸和抗菌活性肽等物質(zhì)阻遏致病菌群的定植（廖波等，2019；李潔等，2014），調(diào)控腸道細胞免疫功能來促進動物機體健康， 因此菌株達到對數(shù)期的時間越短，越能夠發(fā)揮其良好的益生作用。通過測定并制作本試驗分離菌株N 的生長曲線，發(fā)現(xiàn)菌株N 進入對數(shù)期較快，符合篩選菌株的要求。乳酸菌作為外來添加的菌株， 需要經(jīng)過消化道的低pH 環(huán)境后，仍然有著較好的活性，能夠進行生長繁殖，因此需要篩選耐酸、耐膽堿的菌株。本試驗分離的菌株N 對于腸道環(huán)境有著較好的耐受性，可用于制作益生菌添加。

綜上所述， 本試驗從烏雞腸道中分離鑒定到的菌株N 為戊糖乳桿菌，作為同源菌株更有利于在雞腸道內(nèi)定植， 菌株N 在8 h 左右即可到達對數(shù)期，說明其生長特性優(yōu)良。而且菌株N 在pH 為4、膽鹽濃度為0.3%時，仍有良好的生長性能，說明其耐酸、耐膽鹽性能好，表明菌株N 適合作為飼料添加劑的優(yōu)良菌種。