肖福龍，宮麗鴻

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病是冠狀動脈粥樣硬化使管腔狹窄或阻塞，導(dǎo)致心肌缺血、缺氧而引起的心臟病，與冠狀動脈功能性改變即冠狀動脈痙攣統(tǒng)稱為冠狀動脈性心臟病(coronary heart disease，CHD)，簡稱冠心病。近年來，隨著我國國民經(jīng)濟的迅速發(fā)展，人民生活方式和生活水平發(fā)生巨大變化，冠心病的患病率和死亡率也逐漸升高，已經(jīng)成為我國重要的公共衛(wèi)生問題。研究顯示，搜風(fēng)祛痰中藥通過抑制細胞凋亡發(fā)揮穩(wěn)定動脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊的作用，但搜風(fēng)祛痰中藥對同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)損傷的大鼠心肌微血管內(nèi)皮細胞(cardiac microvascular endothelial cells，CMECs)的作用尚未明確[1-4]。本研究探討Hcy對CMECs線粒體凋亡的影響及搜風(fēng)祛痰中藥的干預(yù)作用，為搜風(fēng)祛痰中藥的臨床應(yīng)用提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗細胞 原代大鼠CMECs，購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院公司。

1.1.2 實驗動物 8周齡無特定病原體(SPF)級雄性Sprague-Dawley大鼠40只，體質(zhì)量(240±20)g，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SYXK(遼)2013-0009。所用動物實驗均符合中國有關(guān)實驗動物使用和操作的倫理規(guī)則，并獲得遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會的批準(編號：21000092018010)。

1.1.3 實驗藥物 搜風(fēng)祛痰中藥：全蝎5 g，蜈蚣1條，地龍20 g，陳皮15 g，半夏15 g，白術(shù)15 g，水蛭15 g，加工制成含生藥2 g/mL的中藥濃縮液備用，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥局提供。

1.1.4 實驗試劑與儀器 Hcy(Sigma，69453)；CD31抗體(Servicebio，GB11063-1)；Bax抗體(Cell Signaling Technology，#2772)；Bcl-2抗體(CUSABIO，CSB-RA002611A0HU)；Cyto-C抗體(Servicebio，GB11080)；Caspase-9抗體(Cell Signaling Technology，#9508)；Caspase-3抗體(Cell Signaling Technology，#9662)；β-actin抗體(普利萊，C1845)；辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，SH-0031)；BCA蛋白劑量測定試劑盒(恩晶生物，E1WP2012)；十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠制備試劑盒(索萊寶生物，P1200)；Endothelial Cell Medium培養(yǎng)基(PromoCell，C-22010)；胎牛血清(Sigma-Aldrich，12007C)；EPS 600 電泳儀(Tanon，EPS 600)；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Tanon，5200)；二氧化碳培養(yǎng)箱(ThermoFisher，HERAcell 150i)；超凈工作臺(ThermoFisher，1287)；標(biāo)準規(guī)格酶標(biāo)儀(TECAN，infinite M200)；低溫離心機(Jouan SA，MR1822)。

1.2 實驗方法

1.2.1 原代大鼠CMECs的培養(yǎng)及鑒定 將購買的大鼠CMECs 在37 ℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)瓶內(nèi)細胞生長融合>85%時，用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌，在0.25%胰蛋白酶中消化并傳代到6孔板上，然后在37 ℃孵育約48 h，使細胞黏附并鋪展在基質(zhì)上。第2代～第4代用于后續(xù)實驗。倒置顯微鏡下觀察大鼠CMECs形態(tài)，利用細胞免疫熒光法對大鼠CMECs細胞膜上CD31蛋白的表達進行鑒定[5]。

1.2.2 含藥血清的制備[6]按成人與大鼠的體表面積折算系數(shù)，得出大鼠灌胃用藥量，即搜風(fēng)祛痰中藥低、中、高劑量分別為4.05 g/kg、8.10 g/kg、16.20 g/kg。將40只大鼠按體重分為空白組、搜風(fēng)祛痰中藥低劑量組、搜風(fēng)祛痰中藥中劑量組、搜風(fēng)祛痰中藥高劑量組，每組10只，分別給予生理鹽水、搜風(fēng)祛痰中藥4.05 g/kg、8.10 g/kg、16.20 g/kg灌胃，連續(xù)灌胃7 d，每日2次。在灌胃第7天，給藥1 h后，用10%水合氯醛腹腔注射進行麻醉，腹主動脈取血，存放于促凝管中。在4 ℃下，以3 000 r/min速度離心30 min，分離血清。將同組血清收集后，放在一起混勻，滅活，用過濾器濾過血清除菌，放置在-80 ℃冰箱中保存，備用。

1.2.3 Hcy濃度的選擇 依據(jù)梯度稀釋法，將Hcy設(shè)置為8 mmol/L、4 mmol/L、2 mmol/L、1 mmol/L、0.5 mmol/L、0.25 mmol/L、0 mmol/L共7個濃度。顯微鏡下觀察大鼠CMECs形態(tài)，棄去培養(yǎng)基，加入0.25%胰酶EDTA消化液1 mL，CO2培養(yǎng)箱中孵育2 min。加入完全培養(yǎng)基，終止消化，并加完全培養(yǎng)基至25 mL。在培養(yǎng)板每孔中加入100 μL含有大鼠CMECs的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育24 h。棄去完全培養(yǎng)基，加入細胞外基質(zhì)(ECM)培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育16 h。棄去ECM培養(yǎng)基，在每板中加入7種不同濃度的Hcy，繼續(xù)孵育4 h。酶標(biāo)儀檢測各組細胞OD值。

1.2.4 分組及干預(yù)方法 將正常培養(yǎng)的大鼠CMECs隨機分為5組。①空白對照組：正常培養(yǎng)的大鼠CMECs棄去原培養(yǎng)基，換為ECM基礎(chǔ)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h；②模型對照組：正常培養(yǎng)的大鼠CMECs棄去原培養(yǎng)基，換為含1 mmol/L Hcy的ECM基礎(chǔ)培養(yǎng)基孵育 4 h，換為ECM基礎(chǔ)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h；③搜風(fēng)祛痰中藥高劑量組：正常培養(yǎng)的大鼠CMECs棄去原培養(yǎng)基，換為含1 mmol/L Hcy的ECM基礎(chǔ)培養(yǎng)基孵育4 h后，換為含16.2 g/kg搜風(fēng)祛痰中藥的ECM基礎(chǔ)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h；④搜風(fēng)祛痰中藥中劑量組：正常培養(yǎng)的大鼠CMECs棄去原培養(yǎng)基，換成含1 mmol/L Hcy的ECM基礎(chǔ)培養(yǎng)基孵育4 h后，換成含8.1 g/kg搜風(fēng)祛痰中藥的ECM基礎(chǔ)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h；⑤搜風(fēng)祛痰中藥低劑量組：正常培養(yǎng)的大鼠CMECs原培養(yǎng)基，換為含1 mmol/L Hcy的ECM基礎(chǔ)培養(yǎng)基孵育 4 h后，換成含4.05 g/kg搜風(fēng)祛痰中藥的ECM基礎(chǔ)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.5 細胞收集 對于進行蛋白免疫印跡法(Western

Blot)檢測的細胞，在藥物干預(yù)結(jié)束后，用PBS緩沖液洗滌細胞2次，吸去PBS緩沖液，直接將500 μL RIPA蛋白裂解液加入到培養(yǎng)孔中，4 ℃孵育10 min，收集裂解液，-20 ℃保存待用。

1.2.6 檢測指標(biāo) ①四唑鹽(MTT)法檢測各組細胞生存活性[7]：將大鼠CMECs用胰酶消化后接種于96孔板中，加入含有相應(yīng)劑量藥物的培養(yǎng)液，每孔加入配制好的10 μL MTT貯存液?；靹蚝?，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育4 h；每孔加入150 μL 二甲基亞砜(DMSO)，37 ℃孵育10 min；酶標(biāo)儀上測定570 nm下各個樣本的OD值。②Western Blot檢測各組細胞Bax、Bcl-2、Cyto-C、Caspase-9、Caspase-3蛋白表達：BCA法測定樣品蛋白濃度，并用無菌水調(diào)至2 μg/μL；每個樣品取總蛋白15 μg與SDS上樣緩沖液混合，95 ℃加熱變性5 min；冰上冷卻，4 ℃、10 000 r/min離心10 min；取上清進行SDS-PAGE，電壓維持在100 V；電泳結(jié)束后，用濕轉(zhuǎn)法進行恒流轉(zhuǎn)膜35 min；Tris-HCl緩沖鹽溶液(TBST液)洗膜3次，每次5 min；加封閉液，室溫封閉1 h；TBST液洗膜1次，加入稀釋好的一抗，4 ℃孵育過夜；TBST液洗膜3次，每次5 min；加入稀釋好的對應(yīng)的二抗，室溫孵育1 h；TBST液洗膜3次，每次5 min；將配制好的ECL發(fā)光液加到膜上進行顯色，化學(xué)發(fā)光成像儀檢測成像結(jié)果，Image J 軟件分析條帶的灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠CMECs形態(tài)學(xué)觀察及鑒定 將購買的大鼠CMECs 培養(yǎng)至第5天時，可見細胞匯合成鋪路石樣，詳見圖1。CD31免疫熒光法鑒定顯示所提取的大鼠CMECs 純度大于 95%，詳見圖2。故本實驗采用穩(wěn)定生長的第3代細胞進行后續(xù)實驗。

圖1 倒置顯微鏡下細胞形態(tài)學(xué)觀察(×200)

圖2 CD31免疫熒光法鑒定細胞(×200)

2.2 Hcy濃度的確定 大鼠CMECs鑒定后需要確定Hcy干預(yù)濃度，因此將不同濃度的Hcy分別作用于大鼠CMECs，檢測OD值變化。詳見圖3。

圖3 Hcy濃度篩選折線圖

2.3 搜風(fēng)祛痰中藥含藥血清對Hcy損傷的大鼠CMECs生存活性的影響 與空白對照組比較，模型對照組、搜風(fēng)祛痰中藥低劑量組、搜風(fēng)祛痰中藥中劑量組、搜風(fēng)祛痰中藥高劑量組CMECs生存活性O(shè)D值均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型對照組比較，搜風(fēng)祛痰中藥低劑量組、搜風(fēng)祛痰中藥中劑量組、搜風(fēng)祛痰中藥高劑量組CMECs生存活性O(shè)D值均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。詳見圖4。

與空白對照組比較，＊ P<0.01；與模型對照組比較，# P<0.01。圖4 各組CMECs生存活性柱狀圖

2.4 搜風(fēng)祛痰中藥含藥血清對Hcy損傷大鼠CMECs、Bax、Bcl-2、Cyto-C、Caspase-9、Caspase-3蛋白表達的影響 與空白對照組比較，模型對照組Bax、Bcl-2、Cyto-C、Caspase-9、Caspase-3蛋白表達均升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型對照組比較，搜風(fēng)祛痰中藥中劑量組、搜風(fēng)祛痰中藥高劑量組Bax、Cyto-C蛋白表達均降低，搜風(fēng)祛痰中藥低劑量組、搜風(fēng)祛痰中藥中劑量組、搜風(fēng)祛痰中藥高劑量組Caspase-9、Caspase-3蛋白表達均降低，Bcl-2蛋白表達均升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。詳見表1，圖5。

表1 各組細胞Bax、Bcl-2、Cyto-C、Caspase-3、Caspase-9蛋白表達比較(±s)

圖5 各組細胞Bax、Bcl-2、Cyto-C、Caspase-9、Caspase-3蛋白表達電泳圖

3 討 論

細胞凋亡是指生物體內(nèi)一種生理性的程序性細胞死亡過程，是細胞針對所處環(huán)境因素的特定改變而產(chǎn)生的應(yīng)答。當(dāng)受到外界刺激后，線粒體內(nèi)發(fā)生Ca2+沉積，三磷酸腺苷生成不足，引起線粒體凋亡，最終影響冠狀動脈微血管內(nèi)皮細胞功能[8]。Bcl-2家族分子是線粒體凋亡通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白，主要包括抗凋亡因子Bcl-2等和促凋亡因子Bax等，其能改變線粒體膜通透性，最終引起細胞凋亡[9]。Caspases是細胞發(fā)生凋亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，起始凋亡蛋白酶Caspase-9形成凋亡體，激活下游效應(yīng)凋亡蛋白酶Caspases-3，通過對維持細胞結(jié)構(gòu)及生命活動所必需的蛋白進行裂解，導(dǎo)致細胞結(jié)構(gòu)的破壞及 DNA 損傷斷裂，最終引起細胞凋亡。血管內(nèi)皮細胞是構(gòu)成冠狀動脈內(nèi)壁的主要細胞，具有分泌功能，多種原因誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞損傷是觸發(fā)冠心病的首動因素[10]。研究表明，血瘀型冠心病病人存在凋亡相關(guān)基因Bcl-2的差異表達[11]。

冠心病屬于中醫(yī)學(xué)“胸痹心痛”范疇，風(fēng)痰理論是冠心病的主要病機。現(xiàn)代人運動減少，飲食膏粱厚味致使脾虛生痰，百病皆由痰作祟，痰濁內(nèi)生，困阻血脈，血行不暢，停滯為瘀，痰凝血瘀，痰瘀蘊結(jié)不解而生內(nèi)癰毒熱，熱極生內(nèi)風(fēng)，風(fēng)邪為百病之長，善行而數(shù)變，挾痰入絡(luò)，痰風(fēng)內(nèi)動[12]，筋脈失養(yǎng)，攣急剛勁，痹阻心脈。正如《醫(yī)方考》謂“風(fēng)痰者，濕土生痰，痰生熱，熱生風(fēng)也”，《東醫(yī)寶鑒·痰飲》謂“痰者，津液因熱而成，熱則津液熏蒸而稠濁故名曰痰”。故治療以搜風(fēng)祛痰、祛瘀通絡(luò)為治法，予以搜風(fēng)祛痰中藥，方中全蝎、蜈蚣、地龍3藥共為君藥，白術(shù)、半夏、陳皮合用共為臣藥，水蛭為佐使藥，共奏搜風(fēng)祛痰、祛瘀通絡(luò)之效。

本研究結(jié)果表明，不同濃度Hcy均能夠誘導(dǎo)大鼠CMECs出現(xiàn)損傷，濃度較低時，細胞活性變化較大，說明Hcy濃度對細胞活性影響較為明顯，當(dāng)Hcy濃度>2 mmol/L，曲線趨于平緩，說明Hcy濃度的增加對細胞活性的影響開始變得不明顯。再結(jié)合以往同類研究的文獻報道，因此選擇Hcy濃度為1 mmol/L時，損傷程度最適于本研究，此時細胞損傷程度較為穩(wěn)定。通過檢測線粒體凋亡相關(guān)蛋白來檢測細胞凋亡，與空白對照組比較，模型對照組Bcl-2、Bax、Cyto-C、Caspase-9、Caspase-3蛋白表達均升高(P<0.01)，說明大鼠CMECs在給予Hcy干預(yù)后，促凋亡因子Bax、Cyto-C、Caspase-9、Caspase-3蛋白表達均出現(xiàn)上調(diào)，導(dǎo)致細胞凋亡活動增加，表明細胞凋亡途徑為線粒體凋亡；其中抗凋亡因子Bcl-2蛋白表達亦出現(xiàn)上調(diào)，考慮與內(nèi)皮細胞受到應(yīng)激有關(guān)；與模型對照組比較，搜風(fēng)祛痰中藥組Bax、Cyto-C、Caspase-9、Caspase-3蛋白表達降低，Bcl-2蛋白表達升高，說明搜風(fēng)祛痰中藥含藥血清均能夠通過下調(diào)Hcy損傷的大鼠CMECs凋亡相關(guān)因子中的促凋亡因子Bax、Cyto-C、Caspase-9、Caspase-3蛋白表達、上調(diào)抗凋亡因子Bcl-2蛋白表達來抑制細胞線粒體凋亡。

綜上所述，搜風(fēng)祛痰中藥含藥血清能夠上調(diào)Bcl-2蛋白表達，下調(diào)Bax、Cyto-C、Caspase-9、Caspase-3蛋白表達，抑制細胞線粒體凋亡，從而抑制Hcy誘導(dǎo)的大鼠CMECs損傷。