姜燕強(qiáng)，陳俊麗，陳利平，段國華，張 昆，劉亞利，劉 英

腦出血是指非外傷所致腦血管破裂導(dǎo)致的出血，占腦卒中病人的20%左右，具有高發(fā)病率、高致殘率、高致死率的特點(diǎn)，并且呈現(xiàn)年輕化趨勢[1]。研究表明，腦出血后1個月內(nèi)死亡率超過35%，幸存病人中殘疾者超過50%[2]。腦水腫是腦出血主要并發(fā)癥之一，導(dǎo)致顱內(nèi)壓升高、形成腦疝、腦組織壓迫性受損，是導(dǎo)致病人殘疾和死亡的主要原因[3]。目前，臨床治療腦出血主要采取藥物止血、降壓、保護(hù)神經(jīng)及外科手術(shù)治療等，但都不能很好地控制腦水腫。因此，開發(fā)新的治療藥物和方法抑制腦出血后腦水腫，對改善腦出血預(yù)后具有重要意義。

水通道蛋白(aquaporin，AQP)是一類位于細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)，調(diào)控水在細(xì)胞的進(jìn)出。目前，已在哺乳動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)13種AQP，其中AQP4在腦組織含量最為豐富，主要分布在星形膠質(zhì)細(xì)胞足突與腦血管接觸處，參與介導(dǎo)水在膠質(zhì)細(xì)胞與血管間的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)[4]。鈉-鉀-氯協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Na+-K+-2Cl-co-transporters，NKCC)有兩種亞型，NKCC1和NKCC2，其中NKCC1在大腦神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞中廣泛表達(dá)，對細(xì)胞離子穩(wěn)態(tài)和水轉(zhuǎn)運(yùn)有重要作用[5]。

穿心蓮內(nèi)酯(andrographolide，AND)是中藥穿心蓮的主要有效成分，研究表明，穿心蓮內(nèi)酯對多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有治療作用，包括腦外傷、腦梗死、神經(jīng)退行性病變、腦膜炎，其作用機(jī)制與其抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用有關(guān)[6-9]。本研究旨在探討穿心蓮內(nèi)酯對腦出血后腦水腫的影響并探索其機(jī)制，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物 160只無特定病原體(SPF)級健康雄性SD大鼠，7周齡，體質(zhì)量220～240 g，購自河北省實(shí)驗動物中心，實(shí)驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(冀)2018-004，動物合格號：202004012。分籠飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗，飼養(yǎng)環(huán)境：25 ℃，相對濕度60%～70%，光照黑暗各12 h交替，自由進(jìn)食和飲水。本實(shí)驗經(jīng)武安市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 藥物與試劑 穿心蓮內(nèi)酯購自惠州市九惠制藥股份有限公司(批號：20191217)；尼莫地平(nimodipine，NMP)膠囊購自海南普利制藥股份有限公司(批號：200125)；伊文思藍(lán)(evans blue，EB)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(批號：W20190418)；AQP4、NKCC1、β-肌動蛋白(β-actin)抗體和IgG二抗購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司(貨號：bs-0634R、bs-6945R、bs-0061R、bs-0295G)；異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記二抗購自北京索萊寶生物科技有限公司(貨號：SF068)；2，2-聯(lián)喹啉-4，4-二甲酸二鈉(bicinchoninic acid，BCA)、增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光液(enhanced chemiluminescence，ECL)購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司(貨號：D10616、C05-07004)。

1.3 主要儀器 BN-51700型腦立體定位儀(美國Stoelting公司生產(chǎn))；微量注射器(上海安亭微量進(jìn)樣儀器廠生產(chǎn))；SpectraMax M3型多功能酶標(biāo)儀(美國BioTek公司生產(chǎn))；H-7650型透射電子顯微鏡(transmission electron microscope，TEM，日本日立公司生產(chǎn))；CM1950型切片機(jī)(德國Leica公司生產(chǎn))；Allegra 21R型低溫離心機(jī)(美國Beckman公司生產(chǎn))；EG1150型包埋機(jī)(德國Leica公司生產(chǎn))；SE300型蛋白質(zhì)電泳儀(美國Hoefer公司生產(chǎn))；VE186型轉(zhuǎn)膜儀(上海天能科技有限公司生產(chǎn))；BX51TF型熒光顯微鏡(日本Olympus公司生產(chǎn))。

1.4 分組、模型制備與給藥 采用隨機(jī)數(shù)字表法將160只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、穿心蓮內(nèi)酯 50 mg/kg組和尼莫地平 10 mg/kg組，每組40只。除假手術(shù)組外，其他組大鼠均參照文獻(xiàn)[10]報道的自體血注射法制備腦出血大鼠模型：禁食禁水12 h后，3 mL/kg腹腔注射10%水合氯醛溶液實(shí)施麻醉，經(jīng)左側(cè)股動脈取血后俯臥位固定于腦立體定位儀，沿正中切開頭皮和骨膜、暴露前囟，然后在中線右旁3.5 mm與前囟前0.2 mm交匯處鉆孔，通過微量注射器在腦基底節(jié)區(qū)(深度6 mm)以10 μL/min速度注射50 μL自身股動脈血，無菌骨蠟封閉鉆孔，逐層縫合皮膚。造模完成后，尼莫地平 10 mg/kg組給予2 mg/mL尼莫地平溶液(灌胃體積5 mL/kg)灌胃[11]，每日1次；穿心蓮內(nèi)酯 50 mg/kg組給予10 mg/mL穿心蓮內(nèi)酯溶液(灌胃體積5 mL/kg)灌胃，每日1次，其中，大鼠劑量(mg/kg)=[人給藥量(mg)/人體重(kg)]×5.61，人體重以60 kg計算；假手術(shù)組和模型組給予5 mL/kg生理鹽水灌胃，每日1次。各組灌胃7 d。

1.5 采用改良神經(jīng)功能缺損評分標(biāo)準(zhǔn)(modified Neureological Severity Scores，mNSS)進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分 按隨機(jī)數(shù)字表法每組各取8只大鼠，對照mNSS評分標(biāo)準(zhǔn)對大鼠神經(jīng)功能進(jìn)行評分[12]，得分越高則說明神經(jīng)功能缺失越嚴(yán)重。

1.6 腦血腫體積的測定[11]按3 mL/kg腹腔注射10%水合氯醛溶液實(shí)施麻醉后，頸椎脫臼處死并迅速斷頭、剝?nèi)∧X組織，置于4%多聚甲醛溶液中固定72 h

后，通過高速冷凍切片機(jī)、以注射給藥針孔為中心連續(xù)切片，血腫為暗紅色，檢測血腫最大層面互為垂直的最大橫徑和最大縱徑長度，根據(jù)多田公式計算腦血腫體積，血腫體積=(π/6)×最大橫徑(mm)×最大縱徑(mm)×血腫層數(shù)×切片厚度(mm)。

1.7 失重法測定腦含水量 每組按隨機(jī)數(shù)字表法再各取8只大鼠，麻醉后頸椎脫臼處死并迅速斷頭、剝?nèi)∧X組織，生理鹽水沖洗并拭干，去除小腦和腦干后稱重為濕重(W濕)，置于烘箱中100 ℃烘干至恒重后稱量為干重(W干)，腦含水量(%)=(W濕-W干)/W濕×100%。

1.8 EB法測定血腦屏障(BBB)通透性 每組按隨機(jī)數(shù)字表法再各取8只大鼠，以4 mL/kg尾靜脈注射2%的EB，1 h后以3 mL/kg腹腔注射10%水合氯醛溶液實(shí)施麻醉，開胸暴露心臟，按左心室-右心耳通路由快到慢灌注300 mL生理鹽水，斷頭并剝?nèi)∧X組織，切取右側(cè)半腦、研磨勻漿后加入3倍量甲酰胺溶液(濃度50%)，60 ℃孵育24 h后，3 000 r/min離心10 min取上清液，通過酶標(biāo)儀檢測610 nm波長處吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算腦組織EB含量，腦組織EB含量可反映血腦屏障通透性[13]。

1.9 透射電子顯微鏡觀察血腦屏障超微結(jié)構(gòu)變化 按隨機(jī)數(shù)字表法每組各取8只大鼠，麻醉后頸椎脫臼處死并迅速在冰上取腦組織，經(jīng)4 ℃生理鹽水沖洗干凈后，將腦組織置入pH 7.4、濃度3%的戊二醛溶液中固定72 h，4 ℃下經(jīng)蔗糖緩沖液清洗、1%鋨酸固定1 h、乙醇和丙酮混合液梯度脫水后進(jìn)行包埋，2 μm厚度切片后行蘇木精-伊紅染色，光鏡下觀察定位，60 nm厚度超薄切片后，經(jīng)醋酸鈾避光染色10 min、檸檬酸鉛染色10 min后，通過透射電子顯微鏡觀察血腦屏障超微結(jié)構(gòu)變化。

1.10 免疫熒光法檢測腦組織AQP4、NKCC1蛋白表達(dá) 取1.6步驟制備的腦組織冰凍切片，復(fù)溫后雙蒸水沖洗15 min，置于0.01 mol/L檸檬酸修復(fù)液中、微波修復(fù)5 min，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗15 min后用山羊血清封閉1 h，分別滴加AQP4、NKCC1一抗4 ℃避光孵育過夜，PBS溶液沖洗15 min后滴加FITC熒光素標(biāo)記二抗室溫避光孵育2 h，PBS溶液沖洗15 min后50%甘油封片，然后通過熒光顯微鏡觀察各組大鼠腦組織AQP4、NKCC1蛋白表達(dá)。

1.11 蛋白免疫印跡(Western Blot)法檢測腦組織AQP4、NKCC1蛋白表達(dá) 取各組剩余的8只大鼠，麻醉后頸椎脫臼處死并迅速斷頭、在冰上剝?nèi)∧X組織，取右腦注射給藥針孔周圍腦組織，剪碎后加入4 ℃ RIPA裂解液在冰上靜置30 min使其充分裂解，4 ℃、3 500 r/min離心10 min取上清液，4 ℃、12 000 r/min離心25 min后取沉淀，BCA法檢測總蛋白濃度、沸水浴10 min使蛋白變性后，分別取30 μg蛋白行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨(SDS-PAGE)凝膠電泳(120 V電壓50 min，80 V電壓40 min)分離蛋白，濕法轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯(PVDF)膜后置于5%脫脂奶粉溶液室溫封閉2 h，滴加AQP4(1∶1 000)、NKCC1(1∶1 000)、β-actin(1∶2 000)抗體后4 ℃孵育過夜，洗膜后滴加免疫球蛋白(IgG)二抗(1∶5 000)室溫孵育1.5 h，洗膜后滴加ECL顯色，以目標(biāo)蛋白條帶灰度值與內(nèi)參(β-actin)條帶灰度值的比值計算目標(biāo)蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺失評分、腦血腫體積、腦含水量比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能缺失評分、腦血腫體積明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，穿心蓮內(nèi)酯50 mg/kg組和尼莫地平10 mg/kg組神經(jīng)功能缺失評分、腦血腫體積、腦含水量均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與尼莫地平10 mg/kg組比較，穿心蓮內(nèi)酯50 mg/kg組神經(jīng)功能缺失評分、腦血腫體積明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。詳見圖1。

與模型組比較，＊ P<0.01；與穿心蓮內(nèi)酯50 mg/kg組比較，# P<0.05，△ P<0.01。圖1 各組大鼠神經(jīng)功能缺失評分、腦血腫體積、腦含水量比較(n=8)(A為各組大鼠神經(jīng)功能缺失評分比較；B為各組大鼠腦血腫體積比較；C為各組大鼠腦含水量比較)

2.2 各組大鼠血腦屏障通透性比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織EB含量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，穿心蓮內(nèi)酯 50 mg/kg組和尼莫地平 10 mg/kg組EB含量明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與尼莫地平 10 mg/kg組比較，穿心蓮內(nèi)酯 50 mg/kg組EB含量明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。詳見圖2。

與模型組比較，＊ P<0.01；與穿心蓮內(nèi)酯50 mg/kg組比較，# P<0.01。圖2 各組大鼠血腦屏障通透性比較(n=8)

2.3 各組大鼠血腦屏障超微結(jié)構(gòu)比較 假手術(shù)組大鼠血腦屏障的基膜結(jié)構(gòu)完整，緊密連接結(jié)構(gòu)(tightjunction protein systerm，TJPs)致密，未見異常；模型組血腦屏障可見基底膜薄厚不均勻、膨大，有斷裂現(xiàn)象，緊密連接結(jié)構(gòu)疏松，內(nèi)皮細(xì)胞皺縮等超微結(jié)構(gòu)病變；與模型組比較，穿心蓮內(nèi)酯 50 mg/kg組和尼莫地平10 mg/kg組血腦屏障超微結(jié)構(gòu)病變呈不同程度改善，其中穿心蓮內(nèi)酯 50 mg/kg組效果更為明顯。詳見圖3。

圖3 各組大鼠血腦屏障超微結(jié)構(gòu)(×15 000，n=8)(黑色箭頭指示為基底膜；橙色箭頭指示為緊密連接結(jié)構(gòu)；紅色箭頭指示為內(nèi)皮細(xì)胞)

2.4 各組大鼠腦組織AQP4、NKCC1蛋白表達(dá)比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織AQP4、NKCC1蛋白表達(dá)量明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，穿心蓮內(nèi)酯 50 mg/kg組和尼莫地平 10 mg/kg組AQP4、NKCC1蛋白表達(dá)量明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與尼莫地平 10 mg/kg組比較，穿心蓮內(nèi)酯 50 mg/kg組AQP4、NKCC1蛋白表達(dá)量明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。詳見圖4～圖7。

圖4 各組大鼠腦組織AQP4表達(dá)免疫熒光圖(×100，n=8)

圖5 各組大鼠腦組織NKCC1表達(dá)免疫熒光圖(×100，n=8)

圖6 各組大鼠腦組織AQP4、NKCC1蛋白表達(dá)條帶圖(n=8)(A為假手術(shù)組；B為模型組；C為穿心蓮內(nèi)酯50 mg/kg組；D為尼莫地平10 mg/kg組)

與模型組比較，＊ P<0.01；與穿心蓮內(nèi)酯50 mg/kg組比較，# P<0.01。圖7 各組大鼠腦組織AQP4、NKCC1蛋白表達(dá)比較(n=8)

3 討 論

腦出血是一種起病急、進(jìn)展快且致殘、致死率較高的腦血管疾病，腦水腫引發(fā)顱內(nèi)壓升高及繼發(fā)性腦疝是導(dǎo)致腦出血病人殘疾和死亡的主要原因。目前，臨床上對于腦出血的治療方案均不能很好地控制腦水腫，是腦出血治療中仍待解決的難題[14]。

中醫(yī)藥是具有獨(dú)特理論及技術(shù)方法的醫(yī)藥學(xué)體系，具有悠久的應(yīng)用歷史。腦出血在中醫(yī)屬于“中風(fēng)”范疇，“氣虛血瘀、痰瘀阻絡(luò)”是其主要病機(jī)[15]。中醫(yī)典籍中沒有關(guān)于腦水腫的確切記載，根據(jù)其癥狀當(dāng)屬于“中風(fēng)”“真頭痛”“癇病”等范疇[16]。但關(guān)于腦水腫的相關(guān)病機(jī)，中醫(yī)典籍《證治準(zhǔn)繩》中記載“瘀則液外滲，則成水也”，《血證論》中記載“瘀血既久，化為痰水”。中藥穿心蓮以爵床科植物穿心蓮干燥地上部分入藥，性寒、味苦，具有清熱解毒、涼血消腫之功效。穿心蓮內(nèi)酯為穿心蓮的主要有效成分，化學(xué)結(jié)構(gòu)屬于二萜類內(nèi)酯化合物，具有良好的抗炎活性，目前，臨床上主要用于上呼吸道感染、細(xì)菌性痢疾的治療[17]。尼莫地平為鈣離子拮抗劑類降壓藥，是臨床防治蛛網(wǎng)膜下腔出血等急性腦血管病的常用藥物[18]。本實(shí)驗采用自體血注射法制備腦出血大鼠模型并給予穿心蓮內(nèi)酯進(jìn)行治療，以尼莫地平作為陽性對照藥物，研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)穿心蓮內(nèi)酯或尼莫地平治療7 d能夠明顯降低腦出血大鼠神經(jīng)功能缺失評分、腦血腫體積和腦含水量，并且穿心蓮內(nèi)酯組對神經(jīng)功能、腦血腫體積的影響優(yōu)于尼莫地平組，提示穿心蓮內(nèi)酯對大鼠腦出血后腦水腫和神經(jīng)功能損傷具有抑制作用。

腦水腫根據(jù)誘發(fā)機(jī)制可分為兩大類：細(xì)胞毒性腦水腫和血管源性腦水腫。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞毒性腦水腫在腦出血早期(腦出血后2～24 h)占主導(dǎo)地位，期間主要引發(fā)星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫，尤其是毛細(xì)血管周圍的星形膠質(zhì)細(xì)胞足突，也是AQP4高表達(dá)位點(diǎn)[4]。黃娟[19]的研究表明，AQP4對細(xì)胞毒性腦水腫具有重要的調(diào)控作用。Manley等[20]研究發(fā)現(xiàn)，AQP4 缺失的小鼠細(xì)菌性腦膜炎或局灶性腦缺血等所引起的細(xì)胞毒性腦水腫明顯減輕。血管源性腦水腫在腦出血晚期(腦出血24 h后)占主導(dǎo)地位，引發(fā)細(xì)胞間隙腫脹，與血腦屏障通透性增加密切相關(guān)[21]。血腦屏障是存在于腦組織與血液間的一道選擇性生理屏障，能夠阻止水溶性及部分脂溶性物質(zhì)進(jìn)入腦組織，對維持腦內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)具有重要作用。病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，腦水腫組織中AQP4表達(dá)明顯上調(diào)，其參與各種原因所致腦水腫的形成[22]。魏二佳等[23]研究表明，AQP4表達(dá)量與腦含水量變化呈正相關(guān)，AQP4參與腦出血所致腦水腫的形成過程。NKCC1過度表達(dá)將會導(dǎo)致細(xì)胞腫脹和組織水腫，Gong等[24]研究發(fā)現(xiàn)，抑制NKCC1則能夠減輕腦水腫。本研究結(jié)果顯示，腦出血模型大鼠血腦屏障通透性明顯升高，血腦屏障可見基底膜薄厚不均勻、膨大、斷裂現(xiàn)象，緊密連接結(jié)構(gòu)疏松，內(nèi)皮細(xì)胞皺縮等超微結(jié)構(gòu)病變，與王麗琴等[25]研究報道一致。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)穿心蓮內(nèi)酯或尼莫地平治療7 d能夠明顯降低腦出血大鼠血腦屏障通透性，明顯改善血腦屏障超微結(jié)構(gòu)病變，明顯降低腦組織AQP4、NKCC1表達(dá)，與王橋生等[26]研究報道一致，并且穿心蓮內(nèi)酯上述作用優(yōu)于尼莫地平組，提示穿心蓮內(nèi)酯對腦出血大鼠腦水腫的抑制作用可能與下調(diào)AQP4和NKCC1表達(dá)、降低血腦屏障通透性有關(guān)。

綜上所述，穿心蓮內(nèi)酯具有減輕腦出血大鼠腦水腫的作用，其機(jī)制可能與下調(diào)AQP4和NKCC1表達(dá)、降低血腦屏障通透性有關(guān)。本研究結(jié)果提示，穿心蓮內(nèi)酯可作為腦出血的治療藥物，但AQP4、NKCC1對血腦屏障通透性的影響機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。