潘艷芳，賈曉濤，屈夢揚，方 艷，應(yīng)小平

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一種與年齡相關(guān)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性退行性疾病，主要表現(xiàn)為進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙、精神行為異常、生活能力下降，晚期出現(xiàn)嚴(yán)重癡呆[1]。截至2019年，我國共有1 000多萬例阿爾茨海默病病人，約占全球阿爾茨海默病總數(shù)的五分之一[2-3]，至今仍無法治愈，其發(fā)病機制也尚不明確。研究證實，腦內(nèi)β淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)沉積是阿爾茨海默病形成過程的核心事件[4]。β淀粉樣蛋白可以引起氧化應(yīng)激、軸突損傷和突觸丟失等級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[5-6]。因此，減少β淀粉樣蛋白過度產(chǎn)生和聚集是遏制阿爾茨海默病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵步驟。研究顯示，神經(jīng)炎癥的重要組分白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)能夠通過加快β淀粉樣前體蛋白(β-amyloid precursor protein，APP)的產(chǎn)生來促進(jìn)β淀粉樣蛋白的合成聚積[7]。因此，減少炎性因子IL-1β能夠減少β淀粉樣蛋白的沉積。2019年加州大學(xué)的研究人員在PNAS期刊上發(fā)表的研究表明，一種名為TOM1的蛋白質(zhì)能夠?qū)L-1β及其受體IL-1R帶入胞內(nèi)進(jìn)行降解，減輕炎癥反應(yīng)[8]。當(dāng)歸芍藥散(DSS)是出自《金匱要略》治療阿爾茨海默病療效確切的經(jīng)方，前期研究表明其具有抗衰老、抗炎癥的作用[9-10]。本研究探討當(dāng)歸芍藥散通過IL-1β通路降低腦內(nèi)炎癥反應(yīng)，減少腦內(nèi)β淀粉樣蛋白沉積來防治阿爾茨海默病的機制?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和試劑 快速老化SAMR1小鼠10只、SAMP8小鼠30只均由成都達(dá)碩實驗動物有限公司提供，采用隨機數(shù)字表法對實驗動物進(jìn)行編號，按照機遇均等原則分為SAMR1組、SAMP8組、DSS 15 g/kg組和DSS 60 g/kg組，每組10只。SAMR1組小鼠作為對照組，DSS 15 g/kg組和DSS 60 g/kg組小鼠分別給予15 g/kg、60 g/kg劑量的當(dāng)歸芍藥散灌胃，每日1次；SAMR1組和SAMP8組小鼠給予相應(yīng)體積的生理鹽水(每10 g 0.1 mL)灌胃，每日1次。連續(xù)灌胃8周后進(jìn)行行為學(xué)實驗，實驗結(jié)束后取大腦皮層和海馬組織于-80 ℃儲存待檢測。

1.2 Morris水迷宮實驗 通過水迷宮實驗系統(tǒng)，進(jìn)行小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的檢測。全部測試包括定位航行試驗、空間探索試驗、可視平臺試驗。每天連續(xù)訓(xùn)練4次，每次間隔20 min，連續(xù)訓(xùn)練5 d。自由錄像系統(tǒng)記錄小鼠找到平臺的時間和游泳路徑，4次訓(xùn)練即將小鼠分別從4個不同的起始點(不同象限)放入水中，小鼠找到平臺后或120 s內(nèi)找不到平臺(潛伏期記為120 s)，則由實驗者將其引導(dǎo)到平臺，在平臺上休息10 s，再進(jìn)行下一次試驗。第6天移除平臺，將大鼠放置在起點，記錄小鼠尋找平臺所需的時間以及路徑。主要觀察指標(biāo)有：小鼠找到水下平臺的平均逃避潛伏期和平均逃避距離、撤除平臺后小鼠在目標(biāo)象限內(nèi)的游泳時間和距離百分比以及游泳速度等。

1.3 Y迷宮實驗 通過Y迷宮檢測小鼠的工作記憶能力。Y迷宮由3個夾角為120°的支臂組成。實驗開始時，將小鼠放入3臂的交匯處，讓其自由探索8 min，記錄分析各臂小鼠的進(jìn)入順序、進(jìn)入時間及進(jìn)臂的總次數(shù)以及每次進(jìn)臂的順序，并計算進(jìn)臂正確率。進(jìn)臂正確率=進(jìn)臂正確的次數(shù)/(進(jìn)臂總次數(shù)-2)×100%。

1.4 神經(jīng)炎性因子的檢測 收集的海馬組織用RIPA裂解緩沖液(150 mmol/L NaCl，0.5%脫氧膽酸鈉，5 mmol/L EDTA，0.5%NP-40，50 mmol/L Tris-HCl，pH 6.8)勻漿。將樣品的組織勻漿在4 ℃下全速離心15 min。蛋白質(zhì)定量試劑盒(BCA)法進(jìn)行蛋白濃度測定(試劑盒購自美國Thermo Pierce公司)。采用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測組織裂解物中IL-1β、TNF-α和IL-6水平(試劑盒購自美國R&D公司)。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠Morris水迷宮實驗比較 小鼠Morris 水迷宮行為學(xué)實驗發(fā)現(xiàn)，在連續(xù)5 d尋找水下平臺測試中，與SAMR1組小鼠比較，SAMP8組小鼠尋找水下平臺的日均潛伏期明顯延長(見圖1A)，穿越平臺象限時間和距離占整個游泳時間(見圖1C)或距離(見圖1D)的百分比下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而DSS 60 g/kg組小鼠尋找水下平臺的日均潛伏期較SAMP8組明顯縮短，穿越平臺象限時間和距離占整個游泳時間或距離的百分比均上升，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與SAMP8組小鼠比較，DSS 15 g/kg組小鼠尋找水下平臺的日均潛伏期、穿越平臺象限時間和距離占整個游泳時間或距離的百分比比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

與SAMR1組比較，＊ P<0.05；與SAMP8組比較，# P<0.05。圖1 各組小鼠Morris水迷宮實驗比較(A為尋找水下平臺的潛伏期；B為第5天各組小鼠尋找水下平臺的代表性游泳軌跡；C為目標(biāo)象限的時間百分比；D為目標(biāo)象限的距離百分比)

為了排除藥物對大鼠運動能力的影響，各組小鼠進(jìn)行了水上平臺實驗，結(jié)果顯示，各組小鼠尋找平臺潛伏期(見圖2A)和平均游泳速度(見圖2B)比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖2 各組小鼠水上平臺實驗比較(A為各組小鼠找到水上平臺的時間；B為各組小鼠游泳速度)

2.2 各組小鼠Y迷宮實驗比較 各組小鼠8 min進(jìn)臂總次數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與SAMR1組小鼠比較，SAMP8組小鼠進(jìn)臂正確率明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與SAMP8組小鼠比較，DSS 60 g/kg組小鼠進(jìn)臂正確率明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖3。

與SAMR1組比較，＊ P<0.05；與SAMP8組比較，# P<0.05。圖3 各組小鼠Y迷宮實驗比較(A為各組小鼠總的進(jìn)臂次數(shù)；B為各組小鼠進(jìn)臂正確率)

2.3 各組小鼠神經(jīng)炎性因子水平比較 與SAMR1組小鼠比較，SAMP8組小鼠海馬組織中TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá)量明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與SAMP8組小鼠比較，DSS 60 g/kg組小鼠海馬組織中TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá)量明顯下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖4。

與SAMR1組比較，＊ P<0.05；與SAMP8組比較，# P<0.05。圖4 各組小鼠海馬組織中神經(jīng)炎性因子水平比較(A為IL-1β變化；B為TNF-α變化；C為IL-6變化)

3 討 論

β淀粉樣蛋白沉積形成老年斑是阿爾茨海默病最主要的病理學(xué)特征。研究發(fā)現(xiàn)，腦內(nèi)高淀粉樣蛋白水平與早期阿爾茨海默病密切相關(guān)[11-12]。β淀粉樣蛋白是由細(xì)胞膜上淀粉樣前體蛋白發(fā)生異常剪切和錯誤折疊而產(chǎn)生的[13-14]。在阿爾茨海默病病人體內(nèi)，β淀粉樣前體蛋白經(jīng)過β分泌酶裂解在細(xì)胞膜上產(chǎn)生含有99個氨基酸殘基的胞外片段，此片段包含了完整的β淀粉樣蛋白肽，經(jīng)γ分泌酶裂解，產(chǎn)生具有致病作用的β淀粉樣蛋白，β淀粉樣前體蛋白經(jīng)過γ分泌酶剪切后產(chǎn)生不同長度的β淀粉樣蛋白殘基，其中40和42個氨基酸殘基最多，后者更容易沉積，是形成老年斑的主要物質(zhì)[15]。在腦內(nèi)，特別是大腦皮層、海馬區(qū)β淀粉樣蛋白沉積能自發(fā)地形成β折疊結(jié)構(gòu)，這些β折疊進(jìn)一步堆積就形成了腦中的淀粉樣老年斑，導(dǎo)致突觸損傷和神經(jīng)元丟失[16]。

長期慢性炎癥與β淀粉樣蛋白毒性作用共同損傷神經(jīng)系統(tǒng)，促進(jìn)阿爾茨海默病的發(fā)展。其中，IL-1β信號通路在阿爾茨海默病中發(fā)揮致病作用[17-18]。IL-1β主要通過促進(jìn)β淀粉樣蛋白聚積和神經(jīng)原纖維纏結(jié)參與阿爾茨海默病的致病過程，IL-1β在淀粉樣斑塊形成的早期過度表達(dá)，通過蛋白激酶C途徑促進(jìn)β淀粉樣前體蛋白的合成、分泌，從而促進(jìn)β淀粉樣蛋白的沉積，β淀粉樣蛋白可以激活小膠質(zhì)細(xì)胞，而活化的小膠質(zhì)細(xì)胞可以產(chǎn)生IL-1β等大量細(xì)胞因子，IL-1β可通過旁分泌作用激活星形膠質(zhì)細(xì)胞，使其產(chǎn)生一氧化氮(NO)、IL-6、TNF和載脂蛋白E(ApoE)等，這些產(chǎn)物本身不僅可以造成神經(jīng)元損傷、參與淀粉樣斑塊的形成，而且可以進(jìn)一步激活小膠質(zhì)細(xì)胞，從而產(chǎn)生更多的IL-1β等細(xì)胞因子，形成惡性循環(huán)[19]。當(dāng)歸芍藥散主要由當(dāng)歸、芍藥、川芎、茯苓、白術(shù)和澤瀉6味藥組成。其中芍藥(白芍)養(yǎng)血、川芎活血、當(dāng)歸兼?zhèn)浠钛B(yǎng)血，配以茯苓、白術(shù)、澤瀉健脾滲濕，諸藥合用具有補血活血化瘀、健脾利濕化痰的功效，既補中寓瀉，又瀉中求補，既益氣養(yǎng)血，又化痰逐瘀，切中虛、痰、瘀?，F(xiàn)代網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究顯示，當(dāng)歸芍藥散治療阿爾茨海默病可能與其調(diào)節(jié)炎癥、免疫系統(tǒng)、鈣信號、細(xì)胞與細(xì)胞之間的信號交流等機制有關(guān)[20]。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)歸芍藥散能緩解SAMP8小鼠的學(xué)習(xí)和記憶功能，其機制可能與其降低SAMP8小鼠海馬組織中TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)水平有關(guān)。