南曉晶, 楊舒煒

浙江中醫(yī)藥大學附屬第三醫(yī)院 1檢驗科， 2內(nèi)分泌科(浙江杭州 310009)

自身免疫性甲狀腺炎(autoimmune thyroiditis，AIT)是器官特異性自身免疫疾病，在臨床上較為常見，臨床主要表現(xiàn)為咽部不適、吞咽困難、頸部壓縮等癥狀，且甲狀腺淋巴細胞的浸潤程度不同可導致甲狀腺功能喪失與萎縮，且該病的發(fā)病率受多種因素的影響逐年增加，故尋找該病有效的治療方式相當重要[1-2]。實驗性自身免疫性甲狀腺炎(experimental autoimmune thyroiditis，EAT)的動物模型病理基礎(chǔ)與臨床表現(xiàn)與人類AIT相同，主要用于AIT研究[3-4]。大黃素為蒽醌類衍生物，是中藥大黃莖與干燥根中的有效成分，具有免疫抑制的作用。含有pyrin結(jié)構(gòu)域的蛋白3(NLRP3)/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(Caspase-1)在疾病的發(fā)生中具有重要作用，NLRP3/Caspase-1可通過破壞環(huán)境刺激物、晶體物質(zhì)與病原微生物所激活，參與AIT的發(fā)病機制與機體免疫，有研究顯示，NLRP3通路的激活與AIT相關(guān)?；谏鲜霰尘埃e極尋找此病的發(fā)生機制對臨床上治療的研究具有重要的意義。2020年6—12月，本研究分析大黃素調(diào)控NLRP3/Caspase-1通路對EAT大鼠的免疫調(diào)節(jié)作用，以明確大黃素與EAT大鼠的關(guān)系，為臨床上AIT的診治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 選取SPF級6～8周齡SD大鼠60只，購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，動物許可證號：SCXK(湘)2019-0014，體重(221.05±22.61)g，在相對濕度為29%～35%、溫度為21～24℃下飼養(yǎng)1周，每天光照24 h，明暗周期為12 h。本實驗操作均嚴格參照動物實驗倫理要求相關(guān)規(guī)定進行，且獲得我院醫(yī)學倫理委員會審批同意(ZSLL-KY-2021-036-01)。

1.2 方法

1.2.1 分組與建模 60只中選取12只作為對照組，其余48只大鼠參照侯麗萍等[6]報道的EAT的建立方法構(gòu)建模型，將10 mg pTG(美國Sigma公司)與5 mL PBS進行融合，并與5 mL CFA(美國Sigma公司)進行混合，乳化后制作抗原含量為1 g/L的pTG乳化劑，將乳化劑按照1 mL/kg體重注射于對48只大鼠足墊及背部皮下，每周注射1次，連續(xù)注射2周，此為初次免疫，2周后為加強免疫，將pTG與IFA(美國Sigma公司)混合、乳化制成乳化劑備用，按照1 mL/kg體重注射于大鼠皮下多點，每周注射1次，連續(xù)注射4周，大鼠造模期間注意避光，飲用0.05%碘化鉀水。加強免疫后2周，取1只建模大鼠的眶靜脈血，檢測TPOAb水平，TPOAb滴度≥60 IU/mL為建模成功，建模成功后大鼠死亡8只，將剩余40只大鼠隨機分為模型組、大黃素低劑量組、大黃素中劑量組、大黃素高劑量組各10只。

1.2.2 給藥干預 建模成功后，開始給藥。對照組模型組與給予5 mg/kg生理鹽水進行灌胃，大黃素低劑量組給予生理鹽水+15 mg/kg大黃素，大黃素中劑量組給予生理鹽水+75 mg/kg大黃素，大黃素高劑量組給予生理鹽水+150 mg/kg大黃素。連續(xù)灌胃4周。

1.3 指標觀察

1.3.1 樣本采集 采集大鼠眶靜脈血4 mL，以離心半徑5 cm、3 000 r/min離心處理10 min，分離上層血清，分離大鼠頸部皮膚及肌肉層，顯露出甲狀腺軟骨側(cè)后方兩葉甲狀腺，取出氣管與甲狀腺，使用冷生理鹽水進行沖洗，并吸干。

1.3.2 病理組織學觀察 獲取大鼠甲狀腺組織進行切片、脫蠟、脫水操作，并使用HE進行染色，使用光學顯微鏡觀察其改變。

1.3.3 甲狀腺球蛋白抗體(TgAb)、白細胞介素-4(IL-4)、γ干擾素(IFN-γ)檢測 在用藥結(jié)束后抽取眶靜脈血4 mL，以離心半徑5 cm、3 000 r/min離心處理10 min，分離上層血清，-80℃保存待檢。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)檢測 TgAb、IL-4、IFN-γ水平，TgAb、IL-4、IFN-γELISA試劑盒由滁州仕諾達生物科技有限公司提供。貨號為SND-R423。

1.3.4 外周血CD3+CD4+、CD3+CD8+檢測 抽取各組大鼠眶靜脈血4 mL，制作單細胞懸液，加入抗體與溶血素反應10 min，以離心半徑5 cm、3 000 r/min離心處理10 min，分離上層血清，并加入PBS進行清洗，采用流式細胞儀檢測CD3+CD4+、CD3+CD8+變化。

1.3.5 NLRP3/Caspase-1通路蛋白檢測 采集大鼠甲狀腺細胞，冰上溶解25 min，加入細胞裂解液提取總蛋白，使用BCA試劑盒檢測NLRP3、ASC、Caspase-1等蛋白含量，提取等量蛋白質(zhì)，然后100℃變性5 min，使用凝膠電泳分離，4℃條件下加入一抗孵育過夜，洗滌15 min×3次，加入稀釋好的二抗，孵育2 h，洗滌15 min×3次，定量分析蛋白表達情況。以GAPDH作為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1 組織學觀察 對照組甲狀腺濾泡大小均勻一致，濾泡細胞呈單層立方形或高柱形。模型組甲狀腺濾泡結(jié)構(gòu)紊亂，上皮細胞變扁，間質(zhì)減少，明顯淋巴細胞浸潤。大黃素組甲狀腺濾泡大小不一，少量淋巴細胞浸潤。見圖1。

注：A:對照組; B:模型組; C:大黃素低劑量組; D:大黃素中劑量組; E:大黃素高劑量組

2.2 各組TgAb、IL-4、IFN-γ對比 與對照組相比，其他4組TgAb、IL-4、IFN-γ水平較高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組相比，大黃素低、中、高劑量組TgAb、IL-4、IFN-γ水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而大黃素中劑量組TgAb、IL-4、IFN-γ水平低于大黃素低、高劑量組，比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組TgAb、IL-4、IFN-γ對比

2.3 各組外周血CD3+CD4+、CD3+CD8+對比 與對照組相比，其他4組CD3+CD4+、CD3+CD8+水平較高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，大黃素低、中、高劑量組CD3+CD4+、CD3+CD8+水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而大黃素中劑量組CD3+CD4+、CD3+CD8+水平低于大黃素低、高劑量組，比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

2.4 各組NLRP3/Caspase-1信號通路蛋白表達量對比 與對照組相比，其他4組NLRP3、ASC、Caspase-1水平較高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組相比，大黃素低、中、高劑量組NLRP3、ASC、Caspase-1水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；大黃素中劑量組NLRP3、ASC、Caspase-1水平低于大黃素低、高劑量組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3、圖2。

表2 外周血CD3+CD4+、CD3+CD8+對比

表3 各組NLRP3/Caspase-1信號通路蛋白表達量對比

圖2 NLRP3/Caspase-1通路蛋白WB圖

3 討論

甲狀腺由濾泡上皮細胞組成，為人體內(nèi)分泌器官，可調(diào)節(jié)機體平衡與合成甲狀腺激素[7-8]。AIT是由機體異常識別自身抗原使淋巴細胞侵入甲狀腺組織，使其受損，AIT的發(fā)生多受環(huán)境與遺傳影響，發(fā)病機制不明確，臨床上AIT的治療多使用中醫(yī)藥、局部免疫調(diào)節(jié)及硒，但其毒性、不良反應與復發(fā)可抑制AIT的治療，故臨床上尋找治療此病的藥物十分重要[9-10]。

大黃素又稱朱砂蓮甲素，從大黃根莖中提取[11]。研究顯示[12-13]，大黃素具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、降血脂與調(diào)節(jié)免疫的作用，其免疫保護作用通過調(diào)節(jié)T淋巴細胞之間的平衡發(fā)揮作用，大黃素通過抑制樹突狀細胞的成熟與淋巴結(jié)的活化調(diào)節(jié)免疫抑制。本研究顯示，不同劑量大黃素可降低EAT大鼠中的表達水平，表明大黃素對EAT大鼠具有保護作用。

CD4+CD8+細胞為人體重要的免疫細胞，CD4+主要表達于輔助T細胞，是Th細胞TCR識別的抗原共同體，參與Th細胞TCR識別的信號轉(zhuǎn)導[14]。CD8+表達于細胞毒性T細胞，通過表面的MHC Ⅰ類分子與其他免疫細胞MHC Ⅱ類分子相結(jié)合，識別其他免疫細胞抗原分子[15]。臨床研究顯示，機體的免疫保護作用主要通過大黃素調(diào)節(jié)T淋巴細胞之間的平衡、分化能力發(fā)揮，且大黃素可通過調(diào)節(jié)CD4+/CD8+之間平衡抑制Th1/Th2分化而維持細胞免疫與體液免疫的正常功能，Th1介導細胞免疫主要通過分泌IFN-γ等細胞因子進行[16]。臨床研究表明[17-18]，IFN-γ為促炎因子，可使B細胞進行分化，誘導其成熟，并促進B細胞記憶，且IFN-γ還可使甲狀腺上皮細胞HLA-Ⅱ類抗原表達增強，激活大量單核細胞，使其進入甲狀腺內(nèi)，并使細胞毒性增強。Th2介導體液免疫通過分泌IL-4等抗炎細胞因子進行，可使機體的免疫應答受到抑制，且抗炎因子存在于甲狀腺組織浸潤的單核細胞中，其EAT免疫病情的進展可使抗炎因子表達降低[19]。本研究顯示，EAT大鼠中IFN-γ、IL-4表達升高，大黃素可降低IFN-γ、IL-4在EAT大鼠的表達含量，且中劑量大黃素對IFN-γ、IL-4的降低水平高于低劑量與高劑量大黃素，表明大黃素可保護其EAT大鼠免疫功能，并使Th的細胞因子分泌及分化受到抑制，減輕EAT大鼠的炎癥反應。

NLRP3為胞質(zhì)內(nèi)的模式識別受體，可與ASC形成炎性小體，使Caspase-1活化，NLRP3通過激活Caspase-1促使IL-1β形成活性細胞因子，此在先天免疫中起到關(guān)鍵作用，NLRP3炎性小體由NLRP3、ASC、Caspase-1組成，在AIT中發(fā)揮著重要作用[20]。研究表明[21]，免疫細胞通過NLRP3/Caspase-1參加先天免疫應答，且NLRP3在AIM2介導的甲狀腺濾泡細胞與AIT相關(guān)。在本研究中，NLRP3、ASC、Caspase-1在EAT大鼠中表達升高，對大鼠使用大黃素后NLRP3、ASC、Caspase-1表達降低，且中劑量大黃素對NLRP3、ASC、Caspase-1的降低水平更為顯著，表明大黃素可通過調(diào)節(jié)NLRP3/Caspase-1通路改善EAT。

雖然本研究認為大黃素具有改善EAT的作用，作用機制可能與NLRP3/Caspase-1通路有關(guān)，但此僅為本研究初步結(jié)果，臨床并未有研究分析其關(guān)系，因此本研究上述實驗結(jié)果還需后續(xù)研究進一步探討驗證，為EAT的研究提供新的方向。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，在對EAT大鼠做大黃素干預后，病變明顯被抑制，其作用機制可能與大鼠的NLRP3/Caspase-1失活相關(guān)。

利益相關(guān)聲明：所有作者均聲明不存在任何利益沖突。

作者貢獻說明：南曉晶、楊舒煒：設(shè)計研究方案，實施研究過程，論文撰寫，提出研究思路，分析試驗數(shù)據(jù)，論文審核;楊舒煒：資料搜集整理，論文修改，進行統(tǒng)計學分析。