王云鵬, 張新蔚, 呂旭方, 馬寶亮, 王躍玲, 魏書堂, 徐麗△

河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院 1醫(yī)學(xué)檢驗科, 2消化內(nèi)科(河南開封 475000)

非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH)是非酒精性脂肪性肝病的一種病理類型，與胰島素抵抗及遺傳易感密切相關(guān)的代謝應(yīng)激性肝損傷密切相關(guān)，其持續(xù)存在已成為肝硬化甚至肝癌的重要因素之一，近年發(fā)病率逐年增加[1-2]。研究報道，NASH發(fā)病常與高脂血癥、肥胖癥、糖尿病、代謝綜合征有關(guān)[3]。近年來，隨著基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展以及對NASH研究的不斷深入，相關(guān)基因或蛋白與NASH的關(guān)系逐漸引起人們廣泛關(guān)注。其中，微小RNA(microRNA, miRNA)是一類長度約為18～25個核苷酸的單鏈非編碼RNA，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、分化等一系列生命活動[4-5]。研究報道NASH患者血清中多種miRNA存在差異表達(dá)[6]，并且miR-221-3p在NASH衍生的肝癌中異常表達(dá)[7]，但miR-221-3p在NASH中研究較少。膜聯(lián)蛋白 A1(Annexin A1，ANXA1)是鈣離子依賴的磷脂結(jié)合蛋白超家族中第一個被發(fā)現(xiàn)的成員，廣泛參與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、胰島素分泌以及腫瘤發(fā)生發(fā)展等生理病理過程。研究報道ANXA1是炎癥消退的一種效應(yīng)器，在終止急性炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[8-9]。但有關(guān)miR-221-3p、ANXA1在NASH患者中的表達(dá)及其相關(guān)性研究報道較少。因此，本研究將檢測NASH患者外周血T淋巴細(xì)胞中miR-221-3p、ANXA1表達(dá)水平，并探討兩者表達(dá)與血脂水平、肝功能的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取本院2019年3月至2021年3月收治的128例NASH患者為研究對象(NASH組)，其中男72例，女56例，年齡25～65歲，平均(42.53±8.14)歲，所有患者均具備完整的臨床資料。入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合中華醫(yī)學(xué)會肝臟病學(xué)分會脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組制定的《非酒精性脂肪性肝病診療指南》診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]，具體包括：無過量飲酒史(男性飲酒折合乙醇量< 30 g/d，女性<20 g/d)和其他可以導(dǎo)致脂肪肝的特定原因，肝活組織檢查顯示有肝細(xì)胞脂肪變、氣球樣變和小葉內(nèi)炎癥；(2)患者及家屬知情并簽署同意書；(3)機體其他器官臟器無重大疾病史，無惡性腫瘤病史。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)病毒性肝炎、酒精性肝病、藥物性肝損傷及各種遺傳代謝性肝病患者；(2)臨床資料不全患者；(3)嚴(yán)重心肺腎等器官功能不全者。另外選取同期128名健康體檢者作為對照(健康對照組)，其中男79名，女49名，年齡23～62歲，平均(40.96±9.23)歲。本研究經(jīng)本院道德倫理委員會批準(zhǔn)通過(2019-02-02-k01)。

參照1999年Brunt分級分期標(biāo)準(zhǔn)[11]評估128例NASH患者肝組織炎癥和肝纖維化程度，其中炎癥分級：G1(43例)、G2(64例)、G3(21例)；纖維化分期：S1(39例)、S2(78例)、S3(11例)。

1.2 試劑與儀器 Trizol試劑(貨號15596-026)購自美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號GMS20020.4)購自美國GENMED公司；SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒(貨號RR820A)購自日本Takara公司；人外周血淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll配制，貨號P8900)購自北京Solarbio公司；CD3+T細(xì)胞磁珠分選試劑盒(貨號130-050-101)購自德國Miltenyi Biotec公司；兔抗人CD3單克隆抗體(貨號ab11089)購自英國Abcam公司；所用引物均由上海生工生物工程有限公司合成；熒光定量PCR儀(型號Light Cycler? 480Ⅱ)購自美國Roche公司；流式細(xì)胞儀(型號FACSVia)購自美國BD公司；全自動生化分析儀(型號7600)購自日本日立公司；五分類全自動血液分析儀(型號LH750)購自美國貝克曼庫爾特公司。

1.3 研究方法

1.3.1 樣品采集 (1)外周血T淋巴細(xì)胞制備：采集NASH患者及健康體檢者清晨空腹外周血5 mL/人于含肝素的抗凝管中，接著采用Ficoll密度梯度離心法分離得到外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)，然后參照CD3+T細(xì)胞磁珠分選試劑盒說明，采用免疫磁珠法分離CD3+T淋巴細(xì)胞，最后通過流式細(xì)胞儀檢測CD3+T淋巴細(xì)胞(一抗為兔抗人CD3單克隆抗體)的純度(純度>90%方可用于后續(xù)實驗)，將符合實驗要求的T淋巴細(xì)胞于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)血清收集：采集NASH患者及健康體檢者清晨空腹靜脈血2 mL/人，離心后收集血清，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 qRT-PCR檢測T淋巴細(xì)胞中miR-221-3p、ANXA1 mRNA水平 采用實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測NASH患者及健康體檢者外周血T淋巴細(xì)胞中miR-221-3p、ANXA1 mRNA水平。首先采用Trizol法提取T淋巴細(xì)胞中總RNA，接著按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以cDNA為模板，按照SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明書步驟進(jìn)行，反應(yīng)體系(20 μL)：cDNA(50 ng/μL)2 μL，上下游引物(引物序列見表1)各0.6 μL，SYBR? Green Mix 10 μL，ddH2O 6.8 μL；反應(yīng)條件：95℃，90 s；95℃，30 s；63℃，30 s；72℃，15 s；40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法，以U6為內(nèi)參基因計算外周血T淋巴細(xì)胞中miR-221-3p相對表達(dá)量，β-actin為內(nèi)參基因計算ANXA1 mRNA相對表達(dá)量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3 其他檢測指標(biāo) 由本院檢驗科使用全自動生化分析儀測定血清中血脂指標(biāo)三酰甘油(triglyceride, TG)、總膽固醇(totalcholesterol, TC)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein-cholesterol, HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein-cholesterol, LDL-C)，肝功能指標(biāo)丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine transarninase，ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(γ-glutamyl transpeptidase，GGT)及血糖(glucose，GLU)水平；使用全自動血細(xì)胞分析儀檢測血常規(guī)指標(biāo)紅細(xì)胞計數(shù)(red blood cell count，RBC)、白細(xì)胞計數(shù)(white blood cell count，WBC)、血小板(platelets，PLT)；使用全自動生化分析儀測定空腹血糖和空腹胰島素水平，計算胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model assessment-insulin resistance，HOMA-IR)，HOMA-IR=空腹血糖水平(mmol/L)×空腹血胰島素水平(mIU/L)/22.5。

此外，收集整理所有研究對象一般資料，包括性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)(body mass index，BMI)、腰臀比(waist-to-hip ratio，WHR)、收縮壓、舒張壓等。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料采用“n”表示，行2檢驗；計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，行t檢驗；miR-221-3p、ANXA1 mRNA表達(dá)與血脂水平、肝功能以及肝組織炎癥和肝纖維化程度的相關(guān)性分析采用Pearson法或Spearman法；NASH發(fā)生的影響因素采用多因素logistic回歸分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NASH組及健康對照組一般資料、血常規(guī)指標(biāo)、血脂指標(biāo)、肝功能指標(biāo)及GLU、HOMA-IR水平比較 NASH組BMI、WHR、收縮壓、舒張壓、RBC、WBC、GLU、HOMA-IR及血清中ALT、AST、GGT、TG、TC、LDL-C、表達(dá)水平明顯高于健康對照組，PLT及血清HDL-C表達(dá)水平明顯低于健康對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；NASH組與健康對照組性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2～4。

2.2 NASH組及健康對照組外周血T淋巴細(xì)胞中miR-221-3p、ANXA1 mRNA表達(dá)水平比較 NASH組外周血T淋巴細(xì)胞中miR-221-3p表達(dá)水平明顯高于健康對照組，ANXA1 mRNA表達(dá)水平明顯低于健康對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表5。

2.3 NASH患者外周血T淋巴細(xì)胞中miR-221-3p、ANXA1 mRNA表達(dá)的相關(guān)性 Pearson法分析結(jié)果顯示，NASH患者外周血T淋巴細(xì)胞中miR-221-3p、ANXA1 mRNA表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.665，P=0.000)。見圖1。

2.4 NASH患者外周血T淋巴細(xì)胞中miR-221-3p、ANXA1 mRNA表達(dá)與血脂水平、肝功能的相關(guān)性 Pearson法分析結(jié)果顯示，NASH患者外周血T淋巴細(xì)胞中miR-221-3p表達(dá)水平與TG、TC、LDL-C、ALT、AST、GGT表達(dá)呈明顯正相關(guān)(P<0.05)，與HDL-C表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)(P<0.05)；ANXA1mRNA表達(dá)水平與TG、TC、LDL-C、ALT、AST、GGT表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與HDL-C表達(dá)呈明顯正相關(guān)(P<0.05)。見表6。

表2 NASH組及健康對照組一般資料比較

表3 NASH組及健康對照組血常規(guī)指標(biāo)及GLU、HOMA-IR比較

表4 NASH組及健康對照組血脂及肝功能指標(biāo)比較

表5 NASH組及健康對照組外周血T淋巴細(xì)胞中miR-221-3p、ANXA1 mRNA表達(dá)水平比較

圖1 NASH患者外周血T淋巴細(xì)胞中miR-221-3p、

表6 NASH患者外周血T淋巴細(xì)胞中miR-221-3p、ANXA1 mRNA表達(dá)與血脂水平、肝功能的相關(guān)性

2.5 NASH患者外周血T淋巴細(xì)胞中miR-221-3p、ANXA1 mRNA表達(dá)與肝組織炎癥和肝纖維化程度的關(guān)系 Spearman法分析結(jié)果顯示，NASH患者外周血T淋巴細(xì)胞中miR-221-3p與肝組織炎癥和肝纖維化程度均呈正相關(guān)(r=0.722、0.643，P<0.05)，ANXA1 mRNA表達(dá)與肝組織炎癥和肝纖維化程度均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.626、-0.573，P<0.05)。見圖2～3。

2.6 影響NASH發(fā)生的多因素logistic回歸分析 以NASH是否發(fā)生為因變量(是=1，否=0)，以表2和表3中P<0.05的變量(BMI、WHR、收縮壓、舒張壓、RBC、WBC、PLT、GLU、HOMA-IR、ALT、AST、GGT、TG、TC、LDL-C、HDL-C、miR-221-3p、ANXA1)作為自變量，回歸過程采用“Enter”方法進(jìn)行多因素logistic分析。結(jié)果顯示，BMI、舒張壓、HOMA-IR、ALT、GGT、TG、LDL-C、miR-221-3p是NASH發(fā)生的影響因素(P<0.05)，ANXA1是NASH發(fā)生的保護(hù)因素(P<0.05)。見表7。

圖2 NASH患者外周血T淋巴細(xì)胞中miR-221-3p、ANXA1 mRNA表達(dá)與肝組織炎癥的相關(guān)性分析

圖3 NASH患者外周血T淋巴細(xì)胞中miR-221-3p、ANXA1 mRNA表達(dá)與肝纖維化程度的相關(guān)性分析

表7 影響NASH發(fā)生的多因素logistic回歸分析

3 討論

NASH是我國臨床常見的一種慢性肝炎，嚴(yán)重威脅人類健康，以肝細(xì)胞大泡性脂肪變性、小葉內(nèi)炎性反應(yīng)伴點狀壞死等為病理特征，其是單純性脂肪肝向肝硬化發(fā)展的必經(jīng)環(huán)節(jié)，而且NASH相關(guān)的肝硬化是肝癌發(fā)生的獨立危險因素之一[1-3]，因此探究NASH發(fā)病機制及靶向治療對于預(yù)防肝癌發(fā)生具有重要意義。本研究顯示，NASH患者BMI、WHR、收縮壓、舒張壓、RBC、WBC、GLU、HOMA-IR、TG、TC、LDL-C、ALT、AST、GGT明顯高于健康體檢者，PLT、HDL-C明顯低于健康體檢者，提示NASH患者存在多種代謝紊亂，肝功能下降、血脂異常，且體內(nèi)存在炎癥和胰島素抵抗，與既往研究[2,10,12]一致。此外，有趣的是，本研究中存在僅極少數(shù)NASH患者的ALT、AST略低于健康體檢者，但128例NASH患者的ALT、AST均數(shù)分別約是128例健康體檢者的2倍和1.5倍，而均數(shù)卻在正常范圍內(nèi)，出現(xiàn)這一看似不同尋常現(xiàn)象的原因可能是受實驗儀器、實驗操作等因素影響，導(dǎo)致ALT、AST檢測水平普遍偏低；血清ALT、AST正常也并不意味著無肝組織炎癥損傷。

研究顯示，肝臟作為一個重要的免疫器官，其內(nèi)固有的巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞可通過分泌一些重要的細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子、單核細(xì)胞趨化蛋白等參與NASH發(fā)生、發(fā)展過程中的炎癥反應(yīng)[13]。此外，研究表明，參與細(xì)胞免疫的T淋巴細(xì)胞在NASH患者外周血中亦發(fā)揮重要作用[14]。因此，研究T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞中相關(guān)因子的表達(dá)可能對于指導(dǎo)NASH治療具有重要參考價值。裴豪等[15]研究發(fā)現(xiàn)，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和乙型肝炎病毒特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞在慢性乙型肝炎患者肝組織和外周血中均異常表達(dá)，且肝組織高于外周血?；谝陨涎芯勘尘?，筆者推測肝組織和外周血中T淋巴細(xì)胞在肝炎相關(guān)疾病中均發(fā)揮重要作用，且肝組織中的T淋巴細(xì)胞可能更加活躍。目前，肝穿刺活組織是NASH患者肝組織的來源，其檢查(肝活檢)也是診斷NASH的金標(biāo)準(zhǔn)，但此屬有創(chuàng)性操作，并存在發(fā)生并發(fā)癥、取樣誤差等缺點，且此時取下的組織一般較小，很難有足夠組織標(biāo)本用于其他更多相關(guān)指標(biāo)的檢測，所以影像學(xué)技術(shù)及血液指標(biāo)檢測等無創(chuàng)方法成為人們關(guān)注的熱點。CD3+是成熟T細(xì)胞的重要標(biāo)志，通常代表總T細(xì)胞，故本研究采用免疫磁珠法從外周血中分離CD3+T淋巴細(xì)胞，觀察了NASH患者外周血CD3+T淋巴細(xì)胞中miR-221-3p、ANXA1 mRNA表達(dá)變化。

miRNA通過與靶基因mRNA 3′-非編碼區(qū)互補結(jié)合，從轉(zhuǎn)錄后水平靶向調(diào)控真核生物基因的表達(dá)，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生理生化過程中發(fā)揮重要作用[4-5]。許多研究已表明miRNA的差異表達(dá)與NASH或NASH肝纖維化中發(fā)生密切相關(guān)，其在肝細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞等細(xì)胞的炎癥、應(yīng)激以及肝纖維發(fā)生和進(jìn)展中扮演關(guān)鍵角色[16]。劉佳星等[17]研究發(fā)現(xiàn)，miR-140-5p在NASH患者血清中呈低表達(dá)，并可能通過調(diào)控對氧磷酶1表達(dá)參與NASH進(jìn)展。miR-221位于X染色體p11.3區(qū)域，參與血細(xì)胞生成、血管生成及胰腺癌等惡性腫瘤疾病的發(fā)生，miR-221-3p作為miR-221的一種剪接體，研究報道其高表達(dá)可通過抑制過氧化體增殖物激活型受體γ共激活因子1α生成，導(dǎo)致線粒體功能障礙，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[18]。Conti等[7]研究發(fā)現(xiàn)miR-221-3p高表達(dá)于NASH衍生肝癌小鼠肝組織中，并推測其可作為NASH衍生肝癌發(fā)生的指標(biāo)。紀(jì)奇峰等[19]研究發(fā)現(xiàn)miR-221-3p在肝細(xì)胞癌患者血清外分泌體中的表達(dá)水平顯著高于健康人。本研究對128例NASH患者及128例健康體檢者檢測發(fā)現(xiàn)，NASH患者外周血T淋巴細(xì)胞中miR-221-3p表達(dá)水平顯著高于健康體檢者，且miR-221-3p是NASH發(fā)生的影響因素，提示高水平miR-221-3p可能參與NASH疾病發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。

ANXA1是Ca2+依賴的磷脂結(jié)合蛋白，主要表達(dá)于嗜酸、中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞的亞細(xì)胞顆粒中，在淋巴細(xì)胞中亦有表達(dá)，但在淋巴細(xì)胞的特殊亞群(如靜息CD25-或初始CD45RA CD4 T細(xì)胞)中少量表達(dá)，并在炎癥反應(yīng)、細(xì)胞分化、細(xì)胞信號傳導(dǎo)、細(xì)胞凋亡及腫瘤形成中扮演關(guān)鍵角色[8]。此外，研究表明，ANXA1是一種抗炎因子，能促使淋巴細(xì)胞增殖，促進(jìn)Th1細(xì)胞分化，其失調(diào)與癌癥的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移及耐藥性密切相關(guān)，并且其可能作為某些癌癥的抑癌藥或腫瘤啟動子候選物[20]。夏芊等[21]研究發(fā)現(xiàn)ANXA1在肝癌組織中呈高表達(dá)，可用于肝癌的輔助診斷。韓李春等[8]研究發(fā)現(xiàn)NASH小鼠肝組織中ANXA1基因和蛋白表達(dá)在4～8周與炎癥因子TNF-α、COX-2表達(dá)同步升高，并與肝臟病理炎癥評分呈正相關(guān)，然而12周其表達(dá)明顯下降至接近正常水平，推測這與肝組織纖維化呈負(fù)相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，NASH患者外周血T淋巴細(xì)胞中ANXA1 mRNA表達(dá)水平顯著低于健康體檢者，且ANXA1是NASH發(fā)生的保護(hù)因素，這與Locatelli等[22]研究中ANXA1是小鼠NASH的新型保護(hù)性決定因素相一致，提示ANXA1可能在NASH疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮一定保護(hù)作用，但其是否作為抗炎因子發(fā)揮作用還需進(jìn)一步驗證。

本研究通過Pearson法分析發(fā)現(xiàn)，NASH患者外周血T淋巴細(xì)胞中miR-221-3p、ANXA1 mRNA表達(dá)水平呈明顯負(fù)相關(guān)，表明miR-221-3p與ANXA1可能共同參與NASH發(fā)生發(fā)展進(jìn)程，但兩者間的具體調(diào)控關(guān)系需進(jìn)一步驗證。大量研究表明，脂質(zhì)異常代謝是NASH發(fā)生發(fā)展的主要病理生理機制之一，肝功能是判斷肝臟病變程度的重要臨床檢驗指標(biāo)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，NASH患者外周血T淋巴細(xì)胞中miR-221-3p、ANXA1 mRNA表達(dá)水平與血脂水平、肝功能及肝組織炎癥和肝纖維化程度均呈一定相關(guān)性，表明NASH患者外周血T淋巴細(xì)胞中miR-221-3p、ANXA1表達(dá)可能參與血脂水平的調(diào)節(jié)，進(jìn)而共同參與NASH疾病發(fā)生發(fā)展過程，調(diào)控患者肝臟損傷程度，但其具體機制尚待探究。

綜上所述，NASH患者外周血T淋巴細(xì)胞中miR-221-3p表達(dá)水平較高、ANXA1 mRNA表達(dá)水平較低，兩者呈明顯負(fù)相關(guān)，且與血脂水平、肝功能及肝組織炎癥和肝纖維化程度密切相關(guān)。但本研究仍存在一定的不足之處，僅通過qRT-PCR技術(shù)檢測miR-221-3p、ANXA1表達(dá)變化，后續(xù)還需通過更多途徑或方法進(jìn)一步驗證。此外，本研究未將單純性脂肪肝患者列入研究，這使得外周血T淋巴細(xì)胞中miR-221-3p、ANXA1表達(dá)在單純性脂肪肝進(jìn)展為NASH中的作用未能明確，后續(xù)研究中將進(jìn)一步深入探討miR-221-3p、ANXA1在NASH進(jìn)展單純性脂肪肝、早期NASH、纖維化性NASH、NASH肝硬化中的作用。

利益相關(guān)聲明：本文不涉及相關(guān)利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說明：王云鵬、張新蔚是本研究的設(shè)計者和執(zhí)行人，完成數(shù)據(jù)分析，論文初稿的寫作；王云鵬、張新蔚、呂旭方、馬寶亮、王躍玲參與實驗設(shè)計和試驗結(jié)果分析；王云鵬、張新蔚、徐麗、魏書堂是項目的構(gòu)思者及負(fù)責(zé)人，指導(dǎo)實驗設(shè)計、數(shù)據(jù)分析、論文寫作與修改。全體作者都閱讀并同意最終的文本。