張瑤, 魏若菡

臺(tái)州市第一人民醫(yī)院(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬黃巖醫(yī)院)婦產(chǎn)科(浙江臺(tái)州 318020)

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus, GDM)是在女性妊娠期首次發(fā)現(xiàn)/發(fā)生的一種糖耐量異常疾病，其可使圍產(chǎn)期母嬰并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)升高，而胰島細(xì)胞功能受損、胰島素抵抗(insulin resistance, IR)是GDM患者普遍具有的生理病理特點(diǎn)[1-2]。有研究認(rèn)為，GDM發(fā)病與微小RNA(microRNA, miRNA)表達(dá)失調(diào)、IR、炎癥反應(yīng)、糖脂代謝異常等相關(guān)[3-4]。有關(guān)研究結(jié)果顯示，微小RNA-802(microRNA-802, miR-802)可調(diào)控骨骼肌細(xì)胞對(duì)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)及胰島素的敏感性，其可能是治療2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)的潛在靶點(diǎn)[5]；另外，腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)在GDM患者中呈高表達(dá)，與IR有關(guān)[6]；且miR-802可通過促進(jìn)TNF-α分泌，進(jìn)而影響炎癥性腸病的發(fā)生發(fā)展[7]。因此，推測(cè)miR-802可能與GDM病理過程相關(guān)。本研究初步通過測(cè)定miR-802在GDM孕婦血清、胎盤組織中的表達(dá)水平，分析miR-802與IR、TNF-α的相關(guān)性，以期為臨床診治GDM提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年12月至2020年6月本院82例經(jīng)口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(oral glucose tolerance test, OGTT)(24～28周)確定為GDM的孕婦為GDM組，年齡23～35歲，平均(29.22±3.95)歲；孕周38～40周，平均(39.35±0.64)周；孕前體質(zhì)指數(shù)(body mass index, BMI)為18.07～24.90 kg/m2，平均BMI(21.70±2.40)kg/m2。并納入同期82例經(jīng)OGTT判定為正常糖耐量(normal glucose tolerance，NGT)的孕婦為NGT組，年齡22～35歲，平均(28.75±3.74)歲；孕周38～40周，平均(39.27±0.62)周；孕前BMI為18.15～24.82 kg/m2，平均(21.38±2.31)kg/m2。另外，收集NGT組、GDM組空腹胰島素(fasting insulin, FINS)、總膽固醇(total cholesterol, TC)、空腹血糖(fasting blood glucose, FBG)、三酰甘油(triglycerides，TG)、穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)(homeostatic model assessment insulin resistance, HOMA-IR)(HOMA-IR= FINS×FBG /22.5)等資料。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)GDM孕婦符合《2015年國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)妊娠期糖尿病診療指南解讀》[8]有關(guān)GDM的判定標(biāo)準(zhǔn)，孕期任何時(shí)候血糖值滿足下述任意一條或多條即為GDM:①FBG:5.1 ～ 6.9 mmol/L(92 ～ 125 mg/dL)；②75 g OGTT：1 h 血糖:≥10.0 mmol/L(180 mg/dL)；③2 h 血糖:8.5 ～ 11.0 mmol/L(153 ～ 199 mg/dL)；(2)受試者對(duì)本研究知情同意，且均為單胎妊娠。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)孕前患有糖尿病者；(2)合并高血壓、肝腎功能異常、急慢性炎癥、心功能不全者；(3)合并多囊卵巢綜合征者；(4)服用激素類等藥物或其他因素引起血糖升高者。

本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(20180145)，且其符合《赫爾辛基宣言》要求。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 血清收集：收集NGT組、GDM組孕婦空腹外周血4～5 mL，靜置28～30 min，分離血清(5 000 r/min離心7 min)，置于-70℃冰箱。

胎盤組織收集：所有胎盤娩出后，迅速從胎盤母體面(距臍帶附著1 cm處)剪取1 cm×1 cm×1 cm的組織(避開鈣化、梗死區(qū))，生理鹽水洗3次，立即置于液氮中凍存15 min，之后置于-70℃冰箱。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)法檢測(cè)血清、胎盤組織miR-802、TNF-α mRNA表達(dá)水平 解凍NGT組、GDM組孕婦血清、胎盤組織，利用Trizol Reagent(S30876，上海源葉生物科技有限公司)提取總RNA，使用紫外分光光度計(jì)(DU-730，美國(guó)Beckman公司)測(cè)定樣本總RNA在260 nm、280 nm的吸光度值(A)，將A260/A280比值在1.8～2.0的樣本RNA用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；然后，采用First Strand cDNA Synthesis Kit(YB411A，上海鈺博生物科技有限公司)將樣本RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA；最終，用Perfectstart SYBR Green qPCR master mix(TQ2300-01，美國(guó)OMEGA公司)、qRT-PCR儀(SLAN-96S，上海宏石醫(yī)療科技有限公司)將合成的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增、檢測(cè)。擴(kuò)增條件：98℃預(yù)變性7 min；95℃ 30 s，62.6℃ 30 s，62℃ 10 s，40個(gè)循環(huán)。miR-802、TNF-α內(nèi)參基因分別為U6、GAPDH，其相對(duì)表達(dá)量以2-ΔΔCT法計(jì)算，引物序列見表1。

表1 miR-802、TNF-α及內(nèi)參U6、GAPDH的引物序列

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較 GDM組FINS、TG、FBG、HOMA-IR水平高于NGT組(P<0.05)，GDM組TC水平、孕前BMI、年齡、孕周與NGT組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.2 兩組血清、胎盤組織中miR-802、TNF-α mRNA表達(dá)水平比較 與NGT組相比，GDM組患者血清、胎盤組織miR-802、TNF-α mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見表3。

表2 兩組一般資料比較

表3 兩組血清、胎盤組織中miR-802、TNF-α mRNA表達(dá)水平比較

2.3 GDM孕婦血清、胎盤組織miR-802、TNF-α mRNA表達(dá)水平與FINS、TG、FBG、HOMA-IR的相關(guān)性 GDM孕婦血清、胎盤組織miR-802、TNF-α mRNA表達(dá)水平與HOMA-IR均呈正相關(guān)(P<0.05)。見表4。

表4 GDM孕婦血清、胎盤組織miR-802、TNF-α mRNA表達(dá)水平與FINS、TG、FBG、HOMA-IR的相關(guān)性

2.4 GDM孕婦血清、胎盤組織miR-802表達(dá)水平與TNF-α mRNA的相關(guān)性 GDM孕婦血清、胎盤組織miR-802表達(dá)水平與TNF-α mRNA均呈正相關(guān)(r= 0.532、0.591，P<0.05)。見圖1～2。

3 討論

GDM發(fā)病率呈逐年升高趨勢(shì)，其可引起胎膜早破、難產(chǎn)、巨大兒、T2DM、代謝綜合征、巨大兒、心血管疾病等，對(duì)母嬰安全構(gòu)成威脅[9-10]。HOMA-IR是評(píng)估IR的常用指標(biāo)，本研究中GDM孕婦HOMA-IR、FINS、TG、FBG水平較高，與郭碧蓮等[11]、王孝君等[12]研究相符，提示GDM發(fā)生發(fā)展與IR、糖脂代謝紊亂有關(guān)。探尋與GDM發(fā)病相關(guān)的機(jī)制，對(duì)及時(shí)防治GDM、改善母嬰結(jié)局有積極意義，且其也是目前研究的熱點(diǎn)。

圖1 GDM孕婦血清miR-802表達(dá)水平與TNF-α mRNA的相關(guān)性

圖2 GDM孕婦胎盤組織miR-802表達(dá)水平與TNF-α mRNA的

miRNA是一類非編碼RNA小分子，可穩(wěn)定存在于血清、組織中，其可調(diào)控炎癥反應(yīng)，影響氧化應(yīng)激，調(diào)節(jié)自噬，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮損傷，與GDM、T2DM等關(guān)系密切[13-14]。miR-802是miRNA的一員，與IR、糖代謝有關(guān)，其在T2DM患者血清中呈高表達(dá)，miR-802可作為診斷T2DM的輔助標(biāo)志物[15]；另外，miR-802在肥胖中表達(dá)水平較高，其可損害胰島素轉(zhuǎn)錄、分泌，促進(jìn)IR，miR-802可能是T2DM的治療靶點(diǎn)[16-17]。本研究中GDM孕婦血清、胎盤組織miR-802表達(dá)水平較NGT孕婦顯著升高，提示miR-802可能在GDM發(fā)生發(fā)展中起調(diào)控作用，推測(cè)高表達(dá)miR-802可能通過影響胰島素的分泌、敏感性及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、IR，進(jìn)而影響GDM發(fā)病過程，然而，其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探究證實(shí)。

TNF-α是由血管內(nèi)皮細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等分泌的細(xì)胞因子，其可與相應(yīng)受體結(jié)合進(jìn)而參與細(xì)胞增殖、IR、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；TNF-α還可損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，增加血管通透性，造成血管痙攣，促進(jìn)免疫炎癥反應(yīng)[18-19]。研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α在GDM患者血漿及胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中水平較高，其與GDM疾病嚴(yán)重程度有關(guān)，TNF-α可能是通過促進(jìn)血管內(nèi)皮損傷進(jìn)而在GDM中發(fā)揮促進(jìn)作用[20]。本研究顯示，與NGT孕婦相比，TNF-α mRNA在GDM孕婦血清、胎盤組織中表達(dá)水平較高，與趙莉莉等[20]研究趨勢(shì)一致，提示TNF-α mRNA可能參與GDM病變進(jìn)程，推測(cè)高水平TNF-α可能通過觸發(fā)炎癥反應(yīng)，與其受體相結(jié)合，進(jìn)而影響胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，促使胰島素敏感性降低，引發(fā)IR，從而影響GDM病理變化。

國(guó)春蕾等[21]研究發(fā)現(xiàn)，GDM患者血清TNF-α水平與HOMA-IR呈正相關(guān)，孕早期監(jiān)控血清TNF-α水平有助于提高GDM檢出率，及早干預(yù)，有利于改善母嬰結(jié)局。故本研究從轉(zhuǎn)錄水平分析了GDM孕婦血清、胎盤組織miR-802、TNF-α mRNA表達(dá)水平與FINS、TG、FBG、HOMA-IR的相關(guān)性，結(jié)果顯示，miR-802、TNF-α mRNA表達(dá)水平與HOMA-IR呈正相關(guān)，與國(guó)春蕾等[21]研究結(jié)果相符，提示miR-802、TNF-α mRNA可能與IR共同影響GDM病變過程，推測(cè)miR-802、TNF-α mRNA可能通過介導(dǎo)IR進(jìn)而參與GDM發(fā)生發(fā)展，但具體機(jī)制有待深入研究證實(shí)。此外，Yao等[7]研究發(fā)現(xiàn)，miR-802在結(jié)腸炎中表達(dá)水平較高，其可誘導(dǎo)TNF-α分泌。故本研究分析了GDM孕婦血清、胎盤組織miR-802表達(dá)水平與TNF-α mRNA的相關(guān)性，結(jié)果顯示，血清、胎盤組織miR-802表達(dá)水平與TNF-α mRNA均呈正相關(guān)，提示miR-802、TNF-α mRNA可能共同影響GDM病變過程，但具體機(jī)制需結(jié)合基礎(chǔ)研究加以證實(shí)。

綜上所述，GDM孕婦血清、胎盤組織miR-802、TNF-α mRNA表達(dá)水平較高，與IR關(guān)系密切，miR-802可能是診治GDM的潛在靶標(biāo)。本研究樣本較少，且未深入探討miR-802在GDM中的作用機(jī)制，后期需結(jié)合基礎(chǔ)研究、擴(kuò)大樣本量進(jìn)行深入探究，為臨床診治GDM提供更有力證據(jù)。

利益相關(guān)聲明：所有作者均聲明不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說明：張瑤負(fù)責(zé)研究設(shè)計(jì)、實(shí)施、論文撰寫和修改，魏若菡負(fù)責(zé)指導(dǎo)。